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目的:
探讨原癌基因Pokemon对大肠癌的作用,并初步探讨其作用机制。为大肠癌发生发展机制的研究提供理论依据,为大肠癌治疗方法提供新思路。
方法:
(1)使用免疫组织化学SP法检测pokemon,p14ARF,突变型p53,p21在正常大肠组织,大肠腺瘤和大肠癌中的表达情况。
(2)使用RNA干扰技术,以慢病毒作为载体,构建pokemon稳定沉默的大肠癌LOVO细胞克隆。
(3)使用流式细胞术检测沉默pokemon基因后大肠癌LOVO细胞的细胞周期,凋亡变化,使用CCK-8法检测沉默pokemon基因后大肠癌LOVO细胞增殖变化。
(4)使用x2分析各蛋白在各组间表达的差异性,使用Spearman相关性分析和率相关分析分析各基因表达蛋白间的相关性。
结果:
(1)免疫组织化学实验结果:
①pokemon蛋白在大肠慢性炎,大肠管状腺瘤,大肠癌组织中阳性表达率分别为22.2%、38.1%、75.8%;
②P14ARF蛋白在大肠慢性炎,大肠管状腺瘤,大肠癌组织中阳性表达率分别为93.3%、90.5%、86.4%;
③突变型p53蛋白在大肠慢性炎,大肠管状腺瘤,大肠癌组织中阳性表达率分别为0.00%、5.3%、53.0%;
④p21蛋白在大肠慢性炎,大肠管状腺瘤,大肠癌组织中阳性表达率分别为95.6%、90.5%、86.4%;
a)根据Spearman等级相关分析和率相关分析结果:大肠癌组织pokemon蛋白表达与P14ARF蛋白表达之间没有相关性;
b)根据Spearman等级相关分析和率相关分析结果:大肠癌组织P14ARF蛋白表达与p21蛋白表达之间弱相关性。
c)根据Spearman等级相关分析和率相关分析结果:大肠癌组织突变型p53蛋白表达与p14ARF蛋白表达之间没有相关性。大肠癌组织突变型p53蛋白表达与p21蛋白表达之间没有相关性
(2)细胞学实验结果:
①重组慢病毒滴度可以达到2×108pfu/ml。
②慢病毒感染LOVO细胞的效率可以达80%以上。
③设计的shRNA能够有效的沉默pokemon基因:其mRNA抑制率高达84.3%。蛋白表达明显被抑制。
④沉默pokemon基因后大肠癌LOVO细胞的生长变慢,G1期细胞比例增加,同时早期凋亡比例明显增加。
结论:
(1)pokemon基因在大肠癌的发生发展过程中可能发挥作用,且可能在腺瘤恶变到癌的过程中起作用。pokemon基因在大肠癌发生发展的的作用可能不是通过p14ARF-MDM2-p53/p21通路起作用。
(2)成功构建pokemon稳定沉默的LOVO细胞克隆。
(3)pokemon基因可以促进大肠癌LOVO细胞生长,抑制LOVO细胞凋亡。