背景与目的：SWI/SNF(switch in mating type/sucrose non fermentation)复合物是ATP依赖性染色体重塑复合物家族成员,可以利用ATP水解产生的能量促使染色体构象发生改变,使转录因子易于接近核小体DNA,从而对基因转录进行调控。SWI/SNF复合物在一系列重要生物行为如分化,增生及DNA损伤中发挥重要作用。SWI/SNF复合物由三类亚基构成：一个能利用ATP水解的能量来改变核小体构型的ATP酶性亚基BRG1(SMARCA4)/BRM(SMARCA2);高度保守的核心亚基INI1(SMARCB1, SNF5和BAF47),BAF155(SMARCC1)及BAF170(SMARCC2);功能特异性的辅助亚基PBRM1(BAF180),ARID1A(BAF250A)等INI1(也称为SMARCB1, BAF47, SNF5)位于染色体22q11.23,编码SWI/SNF复合物中重要的核心亚基,出现在所有SWI/SNF复合物中。INI1通过与c-Myc的结合活化c-Myc家族复合物,启动基因的转录。INI1纯合性缺失可导致胚胎在妊娠3.5-5.5天间死亡。INI1基因缺失与INI1失表达首先在肾及肾外恶性横纹肌样瘤、非典型畸胎样/横纹肌样瘤(atypical teratoid/rhabdoid tumor,AT/RT)中发现,并成为其特征性的诊断指标。随后INI1失表达在不同肿瘤中发现：上皮样肉瘤(Epithelioid sarcoma,ES) [5],上皮样恶性神经鞘瘤,肾髓质样癌等。在INI1缺陷的肿瘤中,AT/RT和ES是最常见的。这两种肿瘤不仅都出现了INI1失活,而且组织学可出现多少不等的横纹肌样细胞,通过研究显示INI1失活在这两种肿瘤中发挥了重要的致瘤作用。但这两种肿瘤在生物学行为,发病人群及组织学完全不同：AT/RT常见于3岁以下婴幼儿,即使经过治疗,1-2年内死亡；ES发生于年轻人,肿瘤易复发,但病程长,肿瘤进展缓慢。通过对这两种肿瘤的细胞遗传学及分子学研究发现,两种肿瘤均频繁出现22q11.2的缺失,AT/RT基因改变简单,大多仅出现22染色体异常,但ES不同,其核型复杂,虽然22q染色体最常受累,但其它很多染色体也可累及。这提示尽管在两种肿瘤中均发现了INI1基因的缺失及突变,但在两种肿瘤中,INI1的状态及在致瘤机制中的作用可能并不相同。由于这两种肿瘤较少见,目前只有少数报道,而且部分报道相互冲突。在这两种肿瘤中是否有相同或不同的机制导致了INI1蛋白的丢失仍未明确。了解INI1基因状态不仅有利于我们做出诊断,而且对肿瘤的治疗有重要参考作用。INI1是肿瘤抑制基因,一对等位基因的失活是发生肿瘤的主要机制。除了少数AT/RT及恶性横纹肌样瘤可出现家族性胚系突变[20],导致INI1的一条等位基因失活外,大多数AT/RT及所有的ES(ES至今未见有胚系突变的报道)INI1的两条等位基因失活主要由突变,缺失及表观遗传学等原因造成。表观遗传学改变对肿瘤发生至关重要,可以造成和基因损伤一样的结果。众所周知,肿瘤抑制基因启动子的甲基化可以使基因表达沉默,在各种不同类型的肿瘤发生中有重要作用。INI1基因启动子区有较大的CpG岛,而且在试验中我们发现87.5%(14/16)的ES和25%(2/8)的AT/RT中未检测到导致基因失活的基因损伤,提示INI1启动子甲基化可能发挥作用。随着第二代基因测序技术的出现,通过对肿瘤的全基因组测序发现,除了INI1外,SWI/SNF复合物其它亚基的丢失出现在很多不同的肿瘤中,发挥了肿瘤抑制基因的作用。而且在一种肿瘤中可以同时出现几个亚基的失活,如肾透明细胞癌中同时出现PBRM1和ARIDlA的突变,提示这些亚基可能协同作用,共同在肿瘤的致瘤机制发挥作用。因此除了INI1外,我们还对SWI/SNF复合物中重要且常出现异常的其它亚基进行检测,目前国内外尚无此类研究报道。为此本课题对9例AT/RT及22例ES的临床病理和分子病理学特点进行了深入的回顾性研究。旨在(1)进一步研究AT/RT及ES的临床病理特征,尤其是两种肿瘤的组织学形态谱系的研究。(2)探讨INI1及SWI/SNF复合物PBRM1、BRM、BAF155、BRG1等在AT/RT及ES中的表达及在诊断及鉴别诊断中的作用。(3)利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)及直接测序的分子病理诊断方法在石蜡标本上检测在AT/RT及ES中INI1基因的异常。(4)设计甲基化引物检测AT/RT及ES中INI1启动子甲基化状态,为今后治疗探索新方向。材料和方法：收集南京军区总医院和安徽医科大学第一附属医院病理科1997至2012年,中枢神经系统肿瘤、软组织肿瘤及具有横纹肌样形态的转移癌共173例,参照2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类及2013年WHO软组织及骨肿瘤分类,共诊断9例AT/RT和22例ES,并分别设立对照。对9例AT/RT及22例ES进行光镜观察及免疫组化染色,随访并复习相关文献。对其中INI1抗体阴性且能得到质量合格的DNA的病例包括8例AT/RT及16例ES进行INI1基因直接测序及FISH检查。设计甲基化引物,利用甲基化特异性PCR检测INI1启动子甲基化状态,探讨两种肿瘤的INI1基因失活的机制。结果：一、AT/RT和ES病例的临床及随访资料：22例ES患者男女比例为1.2：1,年龄介于16岁至75岁之间,平均年龄40.2岁。发病部位：其中经典型13例多位于上下肢；近端型9例位于会阴及躯干部。病人多为无痛性缓慢生长的肿块。17例有随访资料的病人中,9例复发,大部分病人出现多次复发,2例肺转移后死亡。9名AT/RT患者男女比例为1.25：1,年龄介于4月至14岁之间,平均年龄7.5岁。发病部位：6例在大脑半球,1例左小脑半球,1例左侧桥小脑角,1例颈部椎管内。病人可出现嗜睡、头痛、面瘫、半侧肢体肌力异常及麻痹等。影像学上AT/RT呈非特异性表现与中枢型PNET或髓母细胞瘤无法区分。8例病人有随访资料,7例病人2年内死亡。二、AT/RT和ES病例的组织特征经典型ES常见肉芽肿样或结节样结构形成伴中心坏死,近端型ES呈多结节形或弥漫形结构,细胞以上皮样细胞和横纹肌样细胞为主,细胞异型性明显。当肿瘤细胞以梭形细胞形成席纹状生长方式,构成纤维瘤样亚型。在例11,肿瘤细胞围绕假血管腔生长,形成血管瘤样亚型。横纹肌样细胞在两型ES中都可见到,但在近端型比例明显增高。尤其2例近端型ES,以横纹肌样细胞为主,形成横纹肌样亚型。AT/RT肿瘤成分复杂,多种成分混杂排列。横纹肌样区域中等-大细胞混杂排列,细胞松散粘附性差,少数病例由形态一致的横纹肌样细胞构成。病例中常见由原始小圆细胞组成未分化小细胞区类似中枢神经系统PNET或髓母细胞瘤。三.AT/RT和ES病例的免疫组化特征：22例ES中,17例INI1蛋白表达缺失,18例PBRM1蛋白表达缺失,INI1及PBRM1的同时缺失出现在16例ES中。2例经典型ES出现了INI1阳性,而PBRM1表达阴性,这两例均为经典型ES。相反,1例纤维瘤样亚型ES,INI1表达阴性,而PBRM1表达阳性。BRM仅在2例具有横纹肌样亚型的近端型ES中缺失,在其余所有ES中,均强阳性表达。BRG1及BAF155在ES的所有病例及对照组中均为阳性。INI1及PBRM1在对照组中除了肾恶性横纹肌样瘤外几乎均为阳性。9例AT/RT中,INI1及PBRM1均失表达,BRM在5例(5/9)病例中阴性,BRM的表达似与细胞形态相关,横纹肌样区BRM失表达,梭形细胞区BRM阳性。INI1及PBRM1在AT/RT的所有对照组中均为阳性,BRG1及BAF155在AT/RT的所有病例及对照组中均阳性。四、INI1失表达的AT/RT和ES病例的INIl基因测序结果：16例ES仅1例经典型ES纤维瘤样亚型的INI1基因3号外显子及4号外显子分别检测到1个错义突变,其余15例均未检测出DNA突变。8例AT/RT病例,6例检测到INI1基因突变,包括3个无义突变,2个移码突变,2个错义突变,2个同义突变。五、INIl失表达的AT/RT和ES病例FISH结果：16例ES病例5例杂合性缺失；2例为纯合性缺失；2例单倍体；7例未见异常。缺失率为56.3%。8例AT/RT中,5例为单倍体,1例为纯合性缺失,2例正常,缺失率为75%。六、AT/RT和ES病例INI1基因启动子甲基化检测：在INI1失表达的16例ES及8例AT/RT中,通过对INIl基因启动子甲基化PCR的检测,未测到基因启动子的甲基化。研究结论：(1)INIl与PBRMl在两种肿瘤中均频繁缺失,提示这两个亚基在肿瘤的发生中可能发挥了协同作用,而且通过对照组研究显示INl1与PBRM1可作为AT/RT与ES诊断及鉴别诊断的重要指标。(2)BRM仅在横纹肌样肿瘤区失表达,且同时伴有INI1与PBRM1的失表达,提示在AT/RT与ES形成过程中,SWI/SNF复合物的多个亚基先后出现了失活。(3)在ES中,INIl基因突变很少,部分病例可出现22号染色体的缺失,但导致INI1失活的基因改变仅出现在少数病例,提示在ES中INI1蛋白的缺失可能与表观遗传学有关。(4)在AT/RT中无义突变、碱基缺失及单倍体形成为其主要分子学特征,提示在AT/RT中INI1蛋白的缺失大多由基因损伤。(5)AT/RT与ES的INI1失活不是由INll启动子区甲基化造成,提示表观遗传学其它机制可能发挥了作用。