论文部分内容阅读
前言椎间盘组织是人体内最大的无血管组织,由髓核和纤维环构成,二者长期处于低氧环境。目前研究表明,随着年龄的增长椎间盘组织出现的基质成分的改变。缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)由HIF-1α和HIF-1β两个亚基构成,其中HIF-1α是主要的功能亚基。在低氧环境中缺氧诱导因子-1α(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)可以通过对靶基因的转录激活,调控血管发生、红细胞生成及糖酵解等过程。目前研究表明,HIF-1α可能在椎间盘退变中发挥重要的作用,但很少有关于HIF-1α和GLUT-1随着年龄变化在椎间盘纤维环组织的表达情况的相关研究。本文观察不同月龄大鼠椎间盘纤维环中HIF-1α和GLUT-1含量变化,进一步探讨两者与椎间盘退变的关系。实验材料和方法一、主要试剂及仪器试剂:兔抗鼠HIF-1α多克隆抗体、兔抗鼠GLUT-1多克隆抗体、链酶亲和素-过氧化物法(SABC)免疫组化即用型试剂盒及DAB(联苯二胺)显色液,兔抗鼠β-actin单克隆抗体,(以上由武汉博士德生物化学试剂公司购买),多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine,Sigma公司),各浓度梯度酒精。仪器:Leitz1512型切片机(Leitz,German),BX60F/PM30-3型显微照相系统(Olympus,Japan),电子天平,微量移液器,组织匀浆器,高压锅,高速离心机,垂直板电泳转移装置,恒温水浴摇床,多用脱色摇床。二、实验取材及实验分组分组:健康Wistar雄性大鼠共50只(中国医科大学实验动物中心提供),分为1,3,6,12,18个月5个月龄组,每组10只。实验室温度20℃-22℃,相对湿度45%-60%。取材:以质量浓度为25g/L戊巴比妥那腹腔过量麻醉处死大鼠,取相同节段腰椎间盘(L4-L5)。每例椎间盘组织分为2份(分别用于免疫组化染色及Westernblot)。一份标本室温下在体积分数0.1的甲醛溶液中固定4d,VonEbner法脱钙2周。常规石蜡包埋后切成4μm厚的切片。将获得的另一份标本在显微镜下分离为髓核与纤维环,迅速置于液氮中,转入-80℃冰箱中备用。三、实验方法、检测指标及染色结果的判断标准(一)实验方法、检测指标:1、免疫组织化学法(SABC法)检测HIF-1α、GLUT-1的表达情况。2、Westernblot免疫印迹法检测HIF-1α、GLUT-1的蛋白的表达情况。(二)染色结果的判断标准1、免疫组化采用DAB显色,HIF-lα的阳性表达为胞核和胞浆内棕黄色颗粒,主要位于胞浆。GLUT-1的阳性表达为细胞膜出现棕黄色颗粒。图片应用BX60F/PM30-3型显微照相系统(Olympus,Japan)彩色病理图文分析系统进行阳性细胞率分析。2、Westernblot法应用Quantity one分析系统将目的条带与β-actin的比值进行统计学分析。四、数据分析采用spss13.0统计软件进行分析,统计方法采用方差分析,各组间两两比较采用LSD法,计算Pearson相关系数分析相关性。实验结果随着大鼠月龄的增长,其椎间盘纤维环组织中HIF-1α和GLUT-1的表达也发生变化,由低月龄组(1-3月龄)至成年组(6-12月龄)HIF-1α和GLUT-1表达逐渐减少,而老年组(18月龄)二者表达显著增加。且这种变化有显著统计学意义(P<0.01)结论1、HIF-1α,GLUT-1表达水平的变化与椎间盘退变的发生关系密切相关。2、HIF-1α可以通过上调GLUT-1等相关因子并延缓椎间盘退变,可能作为椎间盘退变治疗研究的切入点。