萎缩芽孢杆菌XW2胞外蛋白的纯化鉴定及其抑菌机制研究

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由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的杨树炭疽病导致树势衰弱,严重影响并制约杨树正常的生长发育及生态功能的发挥,对经济和生态效益造成巨大损失。对杨树炭疽病的流行及防治已有很多研究,但由于胶孢炭疽菌的侵染机制复杂,目前仍未找到有效的控制办法。因此,明确抑制胶孢炭疽菌生长以及附着胞形成的抑菌物质,探究其靶标位点和作用的基因调控网路,有助于为开发新的杀菌剂以及控制病害提供理论依据。本研究对健康杨树叶片内生细菌——萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrosphaeus)XW2的胞外蛋白进行纯化鉴定,并研究其对胶孢炭疽菌的抑制作用,主要结果如下:(1)通过盐析、柱层析以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法从菌株XW2的发酵液中获得一个抑制附着胞形成的电泳纯抑菌蛋白,其分子量约为20 kDa,等电点约为4.89,并将其命名为BaAFP。(2)明确了 BaAFP的种类为一种2-Cys peroxiredoxin。基于液质联用技术(LC-MS/MS)获得的质谱数据与UniProt数据库比对,得到1 1个特异性匹配的肽段序列,并以萎缩芽孢杆菌XW2基因组DNA为模板,克隆获得BaAFP编码基因,确定其ORF为543 bp,编码180个氨基酸,具有PRXTyp2cys保守结构域,分子式为 C912H1409N241O281S8。(3)构建了 pETM30-BaAFP表达载体,通过BL21(DE3)大肠杆菌表达了具有生物活性的重组BaAFP,并确定了最佳镍柱纯化洗脱液的咪唑浓度为150mM。(4)明确了 BaAFP对孢子萌发没有抑制作用,但影响芽管的萌发、附着胞的形成,会造成菌丝分支及菌丝内隔膜的增多,同时影响胶孢炭疽菌细胞内脂滴及活性氧的分布。通过大肠杆菌原核表达获得重组BaAFP,处理胶孢炭疽菌孢子。培养3-8 h期间,胶孢炭疽菌萌发孢子和芽管内脂质物质增多,孢子内脂质物质不随芽管伸长而减少,同时细胞内活性氧不在芽管尖端积累;12h-20h期间,伸长菌丝加粗,长度变短且分支增多。0.5mg/mL及以上浓度BaAFP处理的胶孢炭疽菌不在gel-bond膜上形成附着胞,0.1 mg/mL及以下浓度的BaAFP处理下,胶孢炭疽菌产生少量附着胞。在BaAFP处理40 h后,继续产生少量畸形附着胞,且在PEG4000处理后崩塌。0.1 mg/mL BaAFP处理导致胶孢炭疽菌在洋葱表皮上不形成附着胞,且菌丝徒长。在杨树叶片上,2mg/mLBaAFP处理的接种部位不产生病斑,但是出现活性氧聚集的情况。
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