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第一部分竹红乙素介导的LED光动力对瘢痕疙瘩成纤维细胞活性和凋亡的影响研究背景瘢痕疙瘩(Keloid)是皮肤科和整形美容外科一种常见的难治性疾病。瘢痕组织是由瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)和细胞外基质(ECM)组成。瘢痕疙瘩成纤维细胞是瘢痕疙瘩组织中最重要的功能细胞,KFB异常增殖和过度分泌细胞外基质是瘢痕疙瘩形成的重要因素。一些学者认为瘢痕疙瘩是一种良性肿瘤。目前缺乏治疗瘢痕疙瘩较为有效的方法。单纯外科手术切除后,其复发率较高,约45-100%。而其他的辅助治疗如:糖皮质激素和/或5氟脲嘧啶局部注射、加压疗法、维甲酸外搽等均可取得一定疗效,如瘢痕变软变薄,但与患者的治疗期望仍相差甚远。较大瘢痕可采取手术联合早期放疗或局部激素封闭,通过抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的形成和减少胶原蛋白的生成等使得瘢痕疙瘩获得治愈或缓解。然而该治疗仍难以避免临床复发,对辐射风险的担忧以及不适于年幼患者等使其临床应用受限。曾有研究表明竹红菌素外涂治疗瘢痕疙瘩有效,但对其作用机制尚不清楚。竹红菌素是从箭竹上的子囊菌纲肉座菌科(Hypocrellabambusae Sace)真菌中提取的3,10-二羟基-4,9-花醌累衍生物,它含有竹红甲素(HypocrellinA,HA)和竹红乙素((HypocrellinB,HB),两者结构近似,相差一个羟基,两者的吸收光谱极为相近。由于独特的立体化学结构决定了它具有较强的光敏性,竹红乙素(HB)与传统的光敏剂血卟啉衍生物(HPD)相比具有许多优势:化学组成单一确定、原料易得易纯化、光敏剂单重态氧量子产率高、光毒性高、暗毒性低、代谢快、易于化学修饰等诸多优点。LED是一种新型的光源,因其波长范围广、光束面积较大、光色均匀、成本低、安全可靠等优点,被广泛应用于医学领域。光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)是一种光敏剂和相应的光源组合应用,利用光动力反应,选择性破坏肿瘤和其他组织。美国食品药品监督管理局已批准该治疗。竹红乙素通过可见光-紫外线全波长扫描显示它在585nm有吸收峰,即有强吸收。585nm波长的光为黄光,可以穿透到达真皮以下。所以我们予以LED黄光照射。黄光LED作为一种新光源,较用于瘢痕治疗的溴化铜激光(578nm)便宜很多,刺激性小,便于患者接受,而瘢痕疙瘩通常需要多次治疗。在我们的实验中,我们研究了竹红乙素(Hypocrellin B,HB)介导的LED光动力(HB-LED)对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响,为探讨HB-LED光动力治疗早期微小瘢痕疙瘩或作为较大瘢痕疙瘩术后的辅助治疗提供了理论依据。目的研究竹红乙素和LED对瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞毒性,探索两者作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞的合适剂量。研究HB-LED光动力对瘢痕疙瘩成纤维细胞活性和凋亡的影响。方法1.以皮肤科门诊切除的瘢痕组织,通过组织块法培养得到原代瘢痕组织成纤维细胞。实验分为阴性对照组(negative controll,NC)、HB组、LED组、HB+LED组。阴性对照组只加DMEM培养液,HB组加入竹红乙素,LED组接受LED黄光照射,HB+LED组加入竹红乙素后接受LED黄光的照射。2.将瘢痕疙瘩成纤维细胞接种于96孔板,加药后3h,将LED组、HB+LED组拿至孵育箱外,以LED治疗仪黄光照射各组细胞,不照光的各组如HB组、阴性对照组也以锡箔纸包裹,拿至孵育箱外放置同样的时间。用改良MTT法检测各组细胞的活力。3.将瘢痕疙瘩成纤维细胞接种于6孔板,加入竹红乙素后,将LED组、HB+LED组拿至孵育箱外,以LED治疗仪黄光照射各组细胞、不照光的各组如HB组、阴性对照组也以锡箔纸包裹,拿至孵育箱外放置同样的时间。以不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶分别消化收集各组细胞,PBS洗涤,AnnexinV-FITC避光、室温孵育细胞15min。每管加PI 5μL,5min后以流式细胞仪进行检测。以BD FACSDiva 7.0软件分析结果。结果1.1以竹红乙素介导的LED光动力处理瘢痕疙瘩成纤维细胞时,3J/cm2是LED黄光的一个合适剂量。1.2在联合3J/cm2的LED黄光的情况下,竹红乙素的半数致死量(IC50)是3.3252×10-7mol/L。2.与阴性对照组(NC)相比,细胞接受处理12h后,在HB+LED组,瘢痕疙瘩成纤维细胞的活性下降50.23%(P<0.001)。单独的HB(1×10-7mol/L)和单独的LED(3J/cm2)也能导致细胞活性的下降,分别是25.77%(P<0.001),16.57%(P<0.001)。3.1瘢痕疙瘩成纤维细胞被处理后6小时,发生明显的凋亡,以晚期凋亡为主,但是也有明显的早期凋亡。HB-LED组最为明显,瘢痕疙瘩成纤维细胞总凋亡率达到57.3%(P<0.001)。单独HB引致总凋亡率达25.77%.单独LED也能引起凋亡,但作用较弱,与NC相比,P=0.042,<0.05.3.2.在对瘢痕疙瘩成纤维细胞的光动力作用中,竹红乙素和LED之间有协同作用,不只是简单的叠加效应。结论1.竹红乙素介导的LED光动力能够有效的降低体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的活性。2.竹红乙素介导的LED光动力能够有效诱导体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡。竹红乙素和LED之间有较好的协同作用。第二部分竹红乙素介导的LED光动力对人瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡信号通路的影响研究背景细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下,受多种基因调控的主动的、程序化的死亡过程,是机体重要的自稳调节机制。近年来通过大量实验研究表明,线粒体凋亡通路在细胞存亡中起着至关重要的作用,而在诸多的凋亡调控基因中,BCL-2家族和胱天蛋白酶(caspase)家族目前最受关注。BCL-2(B-cell lymmpoma/leukemia-2,BCL-2),是一种抗凋亡基因。BAX基因是人体最主要的凋亡基因,研究发现BAX/BCL-2两蛋白之间的比例关系是促发细胞凋亡的关键因素。caspase-3是细胞调亡中的关键蛋白酶,由于它处于凋亡级联反应通路的核心位置,因此被称为死亡蛋白酶。作为第二信使,细胞内钙离子参与调控细胞的增殖、分化和凋亡等过程。在高糖、缺氧及某些药物等刺激因子存在时,细胞内钙离子浓度升高引起钙超载,进而促进细胞的凋亡。为了探讨HB-LED光动力诱发人瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的可能信号途径,本实验对HB-LED光动力处理后的人瘢痕疙瘩成纤维细胞内的BAX,BCL-2,caspase-3和钙离子浓度进行了检测。目的研究竹红乙素介导的LED光动力对瘢痕疙瘩成纤维细胞中凋亡相关基因BAX和BCL-2 mRNA、蛋白质水平的影响,以及对细胞中的钙离子水平、caspase-3活性的影响。探讨HB-LED光动力诱发人瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的可能信号途径。方法1.实时定量PCR检测瘢痕疙瘩成纤维细胞中凋亡相关基因BAX和BCL-2 mRNA水平的变化1.1.用Trizol法提取总RNA,将RNA反转录为模板。1.2.扩增时,先95℃预变性8 min,然后45个循环,每个循环:95℃×15s,59℃×20s,72℃×30s。1.3.用△△Ct法分析结果。2.流式胞内染色法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞中凋亡相关蛋白BAX和BCL-2水平的变化2.1.收集细胞,分组放入流式管内,离心,弃上清,PBS洗2次。2.2.加BioLegend固定液,室温避光孵育15min。离心,弃上清。2.3.加BioLegend破膜液重悬,离心,弃上清。2.4.然后细胞重悬于相应的破膜液中,加荧光标记的抗BAX抗体,抗BCL-2抗体,孵育45min。以FITC标记IgG1和PE标识IgG1做同型对照。2.5.以破膜液洗涤细胞2次。最后每管细胞用500 μL破膜液重悬,上机检测。2.6.用FlowJo 10.0.7软件分析目的蛋白质的量。3.竹红乙素介导的LED光动力对凋亡早期的瘢痕疙瘩成纤维细胞内钙离子水平的影响3.1处理细胞后,吸除培养液,加入Fluo-3AM,37℃孵育30min,PBS洗涤2次。3.2将生长有细胞的盖玻片置于共聚焦显微镜上,选择激发波长为488nm,发射波长为530nm,扫描获取图像。钙离子水平用平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)表示,平均荧光强度通过共聚焦显微镜自带的软件(Imaging Software for Microscopy)分析获得。4.caspase-3活性的测定4.1收集处理过的细胞,PBS洗涤,弃上清,加入裂解缓冲液。4.2将上清按组别小心加入96孔板,每孔再加入乙酰天冬氨缬氨酸对硝基苯胺(Ac-DEVD-pNA),37℃孵育2小时。用酶标仪在405 nm波长处检测样品的吸光度。结果1.与阴性对照组相比,HB-LED组,HB组,LED组的BAX mRNA分别增加了 72.67%,23.33%,6.61%(P = 0.006,<0.05);相反,对比阴性对照组,在以上3组中BCL-2 mRNA的表达则分别下降了 48.57%,26.77%和6.73%(P<0.001)。2.与阴性对照组相比,HB+LED组的BAX蛋白升高了 3倍,而BCL-2蛋白则下降至阴性对照组的17.50%,BAX/BCL-2的比率由阴性对照组的0.1766升高至3.0238。HB组,LED也有相似的变化。3.HB+LED组显著增加了瘢痕疙瘩成纤维细胞内的游离钙水平,与阴性对照组相比,升高了 2.77倍。4.竹红乙素介导的LED光动力可显著增加瘢痕疙瘩成纤维细胞中caspase-3的活性,HB+LED组的caspase-3活性是阴性对照组的5.37倍(P<0.001)。单独的HB和单独的LED也可增加caspase-3活性,分别是阴性对照组的2.37倍和1.15倍(P<0.001,P<0.001)。结论竹红乙素联合LED光动力能明显上调瘢痕疙瘩成纤维细胞内BAX mRNA表达,而下调BCL-2mRNA的表达,在蛋白水平也是如此。此种光动力也上调细胞内游离钙水平和caspase-3活性。线粒体凋亡路径很可能参与了竹红乙素联合LED光动力导致的细胞凋亡。