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研究背景:白藜芦醇,一种天然的多酚化合物,有研究发现其对糖尿病肾病有保护作用。自噬是对细胞有保护作用的现象,糖尿病状态下诱导足细胞自噬的损伤因素明显增多,而在糖尿病肾脏足细胞中具有保护作用的自噬功能存在缺陷,导致损伤进一步加重,因此改善自噬缺陷可起到保护作用。我们假设白藜芦醇可能通过调节自噬起到保护作用。在本研究中,我们使用db/db小鼠(糖尿病小鼠)和体外高糖培养的足细胞,应用白藜芦醇做干预,观察白藜芦醇对自噬水平的调节,以及是否有肾脏保护作用。动物实验中,通过比较正常小鼠组,糖尿病小鼠组,糖尿病小鼠白藜芦醇干预组,进行肾脏皮质的microRNA基因芯片分析,我们筛选出候选基因进行进一步机制探索。方法:1.体内实验,为明确白藜芦醇对糖尿病小鼠肾脏皮质组织的凋亡、自噬反应的作用及其机制,小鼠随机分为四组:正常对照组(db/m小鼠),正常小鼠+白藜芦醇干预组(db/m小鼠+白藜芦醇干预组),糖尿病小鼠组(db/db小鼠),糖尿病+白藜芦醇干预组(db/db小鼠+白藜芦醇干预组)。白藜芦醇治疗12周后,取尾血测血糖,留尿测尿白蛋白水平,眼眶取血测血肌酐水平等指标,称重,取肾脏皮质用于后续HE、PAS染色分析肾小球的直径以及系膜面积,以及荧光染色分析足细胞标志蛋白Synaptododin和自噬蛋白LC3的表达,Western Blot观察凋亡和自噬相关蛋白等的表达。(流程图1)2.体外实验,小鼠足细胞培养,33℃增殖培养而后37℃分化,依据足细胞给予或不给予白藜芦醇预刺激2h,加入或不加入高糖(30 mM)刺激72h的方法:首先分组:分为正糖组,高糖组,高糖+1μM白藜芦醇组,高糖+10μM白藜芦醇组,高糖+100μM白藜芦醇组;其次分组:分为正糖组,高糖组,高糖+10μM白藜芦醇组,高糖+10μM白藜芦醇组+3MA(自噬抑制剂,6-氨基-3-甲基嘌呤),高糖+10μM白藜芦醇组+Rapamycin(自噬诱导剂,雷帕霉素)。检测指标:①用透射电子显微镜观察各组细胞的自噬体形态;②GFP-LC3融合蛋白示踪自噬形成;③Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测;④用Western Blot测各组细胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白、cleaved-caspase 3蛋白的表达水平。(流程图2)3.动物实验三组(正常对照组(db/m小鼠),糖尿病小鼠组(db/db小鼠),糖尿病小鼠+白藜芦醇干预组(db/db小鼠+白藜芦醇干预组),通过miRNAs基因芯片以及RT-PCR分析筛选差异表达的microRNAs,接着,对筛选出的差异表达的microRNA,用Lipo2000通过瞬时mimic和inhibitor转染分析其对自噬的影响,通过Western Blot方法检测LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白、P62蛋白分析自噬情况。(流程图3)4.然后,对筛选出的差异表达的microRNA,利用数据库软件推测并利用双荧光素酶验证其直接靶基因,并通过siRNA沉默表达靶基因,观察靶基因对自噬的影响,也是通过Western Blot方法检测LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白、P62蛋白分析自噬情况。(流程图4)结果:1.对糖尿病小鼠研究发现,白藜芦醇降低糖尿病小鼠的尿白蛋白和血肌酐水平,减小系膜扩张和肾小球体积,对肾脏皮质行Western Blot分析,发现白藜芦醇干预后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的升高提示自噬水平增加,cleaved-caspase 3蛋白水平的降低提示凋亡水平减少。对肾脏皮质行免疫荧光分析发现白藜芦醇干预后反映自噬水平的LC3-Ⅱ蛋白和反映足细胞水平的Synaptopodins蛋白,比糖尿病组荧光值更高,提示白藜芦醇增加肾皮质的自噬水平,保护足细胞。2.对永生化小鼠足细胞研究,利用Western Blot方法,发现与高糖培养组相比,10μM和100μM白藜芦醇预干预组增加反映自噬水平的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值,而降低反映凋亡水平的cleaved-caspase 3蛋白表达。利用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测发现与高糖培养组相比,10μM白藜芦醇预干预组凋亡明显降低。利用GFP-LC3融合蛋白示踪自噬技术发现与高糖培养组相比,10μM白藜芦醇干预组自噬体更明显。接着,我们利用Western Blot方法,发现与10μM白藜芦醇干预组相比,加用3MA显著增加反映自噬水平的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值,也增加反映凋亡水平的cleaved-caspase 3蛋白表达;而加用Rapamycin显著降低反映自噬水平的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值,增加反映凋亡水平的cleaved-caspase 3蛋白表达。利用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测发现,与白藜芦醇干预组相比,加入3MA组和加入RAPA组,细胞凋亡明显增加。利用透射电子显微镜,发现与白藜芦醇干预组相比,加入3MA组和加入RAPA组细胞凋亡小体明显,加入RAPA自噬体明显。提示白藜芦醇可能通过适当程度增加自噬水平改善高糖状态下足细胞凋亡,而过度增加自噬或过度抑制自噬均增加足细胞凋亡。3.动物实验中,对三组小鼠(正常对照小鼠db/m组,糖尿病小鼠db/db组,糖尿病小鼠db/db+白藜芦醇干预组)取肾皮质行microRNA基因芯片分析,分析差异表达的microRNAs,发现microRNA-18a-5p是其中一个显著差异表达的microRNA,表现为在糖尿病小鼠db/db组下调,白藜芦醇干预后被上调。同时利用qRT-PCR技术证实了这一结论。4.接着,培养足细胞,我们用Lipo2000通过瞬时mimic和inhibitor转染分析技术,发现microRNA-18a-5p mimic发现能够增加反映自噬水平的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值,减少P62蛋白的表达,提示自噬增加。而miR18a-5p inhibitor则结果相反。双荧光素酶报告基因分析证实ATM基因是miR-18a-5p的靶基因。动物实验中发现,ATM蛋白在db/db小鼠中高表达,而在白藜芦醇干预后表达降低。在足细胞中,沉默ATM基因发现能够增加反映自噬水平的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值,减少P62蛋白的表达,提示自噬增加。结论:白藜芦醇能够改善蛋白尿,是一个自噬促进剂。白藜芦醇上调microRNA-18a-5p。而 microRNA-18a-5p mimic 能够增加自噬。ATM 基因是miRNA18a-5p的靶基因,沉默ATM基因能够增加自噬。因此我们推测白藜芦醇可能通过上调miRNA18a-5p参与足细胞或糖尿病肾病的保护作用,而miRNA-18a-5p可能通过作用靶基因ATM参与自噬过程,进而参与足细胞或糖尿病肾病的保护作用,因此说是miRNA18a-5p及其靶基因ATM可能是进一步改善糖尿病肾病的潜在研究靶点。