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背景：缺血性脑血管病已成为临床上的常见病、多发病，致残率、病死率及复发率均高。近年来，影像学发展突飞猛进，血管内介入治疗脑血管病在临床上广泛开展，使缺血性脑血管病复发率、病死率显著降低。但是由于经皮血管成形术（percutaneoustransluminal angioplasty PTA）如支架植入、球囊扩张等导致血管狭窄部位局部损伤，引起血管过度修复反应，导致术后再狭窄成为了该项治疗的发展的瓶颈。一项CREST试验研究表明，颈动脉支架术后，两年内再狭窄的发生率为6.0%，在吸烟、高血压、高血脂及糖尿病患者发生率更高[1]。因此再狭窄防治不容忽视。在血管成形术后再狭窄的病理生理机制研究中，人们发现血管内皮细胞的损伤是这一系列病理过程的始动因素[2]，可以引起血管平滑肌细胞病理性增殖等系列改变。而炎症反应在内皮损伤中起关键的作用[3]。因此，血管成形术以后炎症反应的防治成为了防治再狭窄的关键。目前大量研究表明A20基因是内皮细胞保护性基因，同时具有抗炎作用[4-5]，因此A20基因可能具有抑制再狭窄的作用。我们前期研究发现携带A20基因的血管内支架能明显改善支架术后再狭窄，说明通过A20修饰可构建具有抗再狭窄作用的血管内支架[6]。但是支架直接携带目的基因存在着效率低、稳定性差等问题。人工锌指转录因子（zinc finger–artificialtranscription factor ZF-ATF）技术能够高效稳定地诱导目的基因表达。本课题主要构建A20基因ZF-ATF的真核表达载体，启动内源性A20基因的高水平表达，研究其生物学功能，为最终构建拥有自主知识产权的ZF-ATF修饰的血管内支架奠定基础。目的：1.构建A20基因的人工锌指转录因子（ZF-ATF）的真核表达载体。2.观察ZF-ATF转染人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）后对内源性A20基因的表达调控及对HUVEC细胞增殖、迁移能力的影响。3.研究人工锌指转录因子对LPS诱导的内皮细胞炎症反应的影响并探讨其可能的机制。方法：1.根据人A20基因ZF-ATF的序列，设计出其引物，以质粒DNApUC19-ZF-ATF为模板，通过PCR扩增出目的基因片段ZF-ATF，再通过BamH Ⅰ和KpnⅠ酶切后的载体连接产生ZF-ATF真核载体，重组质粒转化感受态细菌DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒，限制性内切酶酶切鉴定，鉴定阳性克隆进行测序。2. ZF-ATF转染HUVEC细胞，用含G418300μg／mL的1640培养液进行稳定细胞株的筛选。3.通过Western blot检测转染ZF-ATF后内皮细胞内源性A20蛋白的表达。4. MTT实验观察转染ZF-ATF后HUVEC细胞的增殖能力，transwells实验检测HUVEC细胞迁移能力。5.用脂多糖（LPS）诱导HUVEC细胞产生炎症反应，利用Western blot检测NF-κBp65的表达情况，利用ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-8等。6.实验数据采用GrapPad Prism5软件处理，Mann-Whitney U检验用于比较炎症因子的差异。结果：1.通过限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序证实ATF插入正确，成功构建A20人工锌指转录因子的真核表达载体。2. ZF-ATF转染HUVEC细胞，成功筛选出HUVEC细胞稳定表达系，Western blot证实ZF-ATF转染HUVEC后内源性A20蛋白表达量显著增加（P＜0.01）。3. ZF-ATF转染HUVEC细胞后抑制了其增殖能力，增强了迁移能力。4. ELISA法检测结果表明，LPS刺激前后，空载组及空白组细胞因子表达存在统计学差异，LPS刺激后均明显上调(空白组IL-6:126±28.8vs738±70.1， IL-8：110±33.9vs724±72.3，TNF-α：9.8±1.5vs41±8.9，P＜0.05；空载体组：IL-6：134±11.4vs712±110.3，IL-8：110±29.1vs762±10.6， TNF-α：7.6±2.3vs42±9.1P＜0.05)，ZF-ATF转染组细胞因子也有明显上调（IL-6:130±35.4vs292±44.9， IL-8：96±18.2vs328±76.3，TNF-α：7.2±2.6vs21±4.2P＜0.05），但ZF-ATF转染组细胞因子的上调水平没有空白组及空载组上调水平高，存在统计学差异（IL-8、IL-6P＜0.01，TNF-α P＜0.05），ZF-ATF转染组与空白组比较细胞因子表达存在统计学差异（IL-8、IL-6P＜0.01，TNF-α P＜0.05），而空载组与空白组比较LPS刺激前后细胞因子的表达均无统计学差异（P＞0.05）。Western blot证实在LPS刺激后ZF-ATF转染组NF-κB p65的表达（19.8±4.5）较空载组（90.2±5.9）及空白组（96.3±3.3）显著下调（P＜0.01）。结论：1.成功构建人工锌指转录因子真核表达载体，且能够启动内源性A20基因的稳定表达。2. ZF-ATF转染内皮细胞能够抑制内皮细胞的增殖，增强内皮细胞的迁移能力。3. ZF-ATF转染内皮细胞能够抑制LPS诱导的内皮细胞炎症反应，其机制可能与A20通过阻断NF-κB通路有关。4. A20通过阻断NF-κB通路抑制炎性细胞因子的表达。