蛋白质组学微量样本制备新技术及在肝癌研究中的应用

来源 :广东药科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:snailswuya
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和质谱技术、样本分离技术的快速发展相比,针对微量样本的制备技术显得比较滞后。样本处理的一般步骤包括提取蛋白质、蛋白质变性、蛋白质还原反应、蛋白质烷基化反应、蛋白质酶切以及这些过程中样品的洗涤、转移、热干等。复杂的样本制备流程需要较高的蛋白质起始量。与之类似的,针对翻译后修饰,如糖基化、磷酸化等的蛋白质组学研究,则需要更多的起始蛋白量。而在越来越多的应用场景中,能够获得的蛋白量非常有限,例如通过流式细胞术、超速离心等分选获得的细胞、亚细胞样本,临床上针对肿瘤检测的穿刺样本、病理切片组织、小体积的体液样本等,如果单纯依靠现在的技术手段只能得到较低质量的数据。因此,本论文研究将致力于发展适用于微量蛋白质组学样本处理的装置和技术流程,并用于微量细胞、尿液样本的蛋白质组学及糖组学分析。微血管侵犯(MVI)指的是肿瘤细胞向小血管的侵袭,它与肝细胞癌预后好坏密切相关。目前MVI的确认仅能从手术后标本中诊断,术前很难判断。因此,本研究的第二个内容,是尝试将微量蛋白质组学技术和肝细胞癌癌组织蛋白质组、尿蛋白质组研究结合,探索发现可提示MVI存在与否的潜在尿蛋白标志分子。本论文分为三个章节第一章:首先简述基于生物质谱的蛋白质组学技术,综述了微量样本制备技术的研究进展、肝细胞癌微血管侵犯研究进展,随后提出本论文的研究目的和意义。第二章:建立了微量样本制备技术Micro-SPAT(Micro sample preparation technology)。该技术采用封闭的样本制备空间,合并并减少操作步骤,降低了样本的损失和被污染的可能性,将样本消化和反相脱盐无缝结合,避免了肽段的热干、重溶等步骤带来的样品损失。在最大程度上降低样本的损失后,采用了Lys-C和Trypsin两步酶切的方案将肽段漏切降低至20%以下。在N-糖链制备方案上,优化了HILIC填料富集实验的步骤,将实验时间从190 min降低至10 min,满足了N-糖链从C18-Tip洗脱至HILIC-Tip的无缝衔接,在补充ACN和TFA后直接进行N-糖链的富集实验。Micro-SPAT可以在离心机内批量化处理,从而同时实现样品制备的高通量。第三章:建立了基于数据非依赖扫描(DIA)技术的尿蛋白快速定量策略。使用6例健康人和6例肝细胞癌患者尿液样本建库,共得到3670种蛋白,25346条肽段。结合Micro-SPAT蛋白消化方案建立肝细胞癌患者尿液蛋白质组分析流程。样品制备以2 ml尿液为起始量,经过超滤浓缩处理后,取10μg蛋白消化,以DIA采集模式进行质谱分析,最终69个样本共鉴定2899种蛋白,平均每个样本鉴定到1714种蛋白,11576条肽段。MVI是肝细胞癌患者预后不良的因素之一。对前期研究发现的S-Ⅰ(肿瘤偏良性)型中MVI-和S-Ⅲ(肿瘤偏恶性)中MVI+患者的癌组织样本进行差异分析,得到2263种差异蛋白。KEGG分析发现显著上调的基因参与多条与肿瘤相关的信号通路,例如B细胞和T细胞受体信号通路,与肿瘤适应低氧环境有关的HIF-1信号通路,促进血管生长的VEGF信号通路。对S-Ⅲ型中MVI-和MVI+患者的癌组织样本进行差异分析,共得到492种差异蛋白。MVI+患者中上调基因通过调控细胞粘附、微管的作用影响肿瘤的转移和侵犯。肝细胞癌患者的尿液样本蛋白质组学研究,MVI+和MVI-两组进行差异分析,共鉴定到71种差异基因,在上调基因中发现与外泌体相关的CHMP5。
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