论文部分内容阅读
目的:明确地西他滨（DAC）促进结肠癌细胞HT29增殖的药物浓度以及该浓度对HT29细胞增殖能力,细胞周期和细胞形态学的影响。材料与方法:选择HT29人源结肠癌细胞系。根据是否采用DAC处理分两组:（1）DAC处理组:含不同终浓度DAC(10-3至100μM)的DMEM培养基处理的HT29结肠癌细胞。（2）对照组:普通DMEM培养基培养的HT29结肠癌细胞。采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法和细胞平板克隆形成实验检测细胞增殖水平。进一步选择终浓度0.1μM的DAC处理HT29肠癌细胞,计算相对细胞活力,绘制生长曲线。流式细胞术检测细胞周期,7-AAD和Annexin V-PE双染检测细胞凋亡。连续变量采用t检验、单因素方差分析或重复测量方差分析进行比较。使用Graph Pad Prism 7软件、R 3.5.1软件或SPSS 20.0软件进行分析。P值<0.05提示差异有统计学意义。结果:与对照组相比,在10-3至0.1μM浓度范围内,DAC促进HT29肠癌细胞的增殖,而在1至10μM浓度范围,DAC对HT29肠癌细胞的活力无影响,当浓度大于100μM时,DAC抑制HT29肠癌细胞增殖。进一步选择终浓度0.1μM的DAC处理HT29肠癌细胞,计算相对细胞活力,绘制生长曲线。与对照组相比,0.1μM的DAC促进HT29肠癌细胞增殖,至第5d,0.1μM DAC组的相对细胞活力为157.7%（P<0.05）。0.1μM DAC处理可增加HT29肠癌细胞的克隆形成能力,而1μM DAC轻度抑制HT29肠癌细胞的克隆形成能力。HT29肠癌细胞呈鹅卵石状,经0.1μM DAC处理48小时后,HT29肠癌细胞呈梭形,具有间充质细胞形态。0.1μM DAC处理使HT29肠癌细胞的S期细胞比例增加（DAC组比对照组:27.0%比14.7%,P<0.01）,而G1期细胞比例下降（DAC组比对照组:57.4%比67.6%,P<0.01）,提示低浓度DAC处理促进G1/S转换。低浓度DAC(范围:10-2至10μM)可轻度降低HT29肠癌细胞早期凋亡和总凋亡率。结论:低浓度DAC促进HT29肠癌细胞增殖及克隆形成、增加HT29肠癌细胞S期比例、轻度抑制HT29肠癌细胞凋亡、使HT29肠癌细胞获得间充质细胞形态。目的:从系统生物信息学角度探索DAC促HT29结肠癌细胞增殖的机制。材料与方法:从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）下载三组微阵列数据集（数据集编号GSE41364、GSE32323、GSE22598）,通过趋势聚类分析（Series test of cluster,STC）和加权共表达网络分析（Weighted gene coexpression network analysis,WGCNA）,探索随着DAC浓度变化（0μM、5μM和10μM）,HT29结肠癌细胞系的核心通路变化,接着通过基因集变异分析（Gene set variation analysis,GSVA）,拟合并评估不同DAC浓度处理下,HT29结肠癌细胞的这些信号通路的激活水平。最后综合运用多个数据集,初步验证这些核心通路的核心基因在转录水平的表达变化。结果:STC分析结果提示,随着DAC处理浓度的递增,其转录组基因转录水平变化趋势可归纳为8个趋势模式,总体转录水平呈上升趋势。选择其中P值最小的趋势（即“趋势6”,共包含2893个基因,P=3.7E-169）进一步行信号通路富集分析。WGCNA分析提示,共有6个模块与DAC治疗相关,纳入进一步分析。通过对WGCNA分析中与DAC处理存在强相关性的模块基因,以及趋势6数据集内的基因进行生物学过程、信号通路富集和分子功能富集分析。结果提示不同DAC处理HT29肠癌细胞可改变如下细胞功能和信号通路:（1）E2F介导的细胞周期蛋白E相关G1/S转换;（2）凋亡通路;（3）上皮-间质转化（EMT）途径的调控。采用GSVA分析不同浓度DAC（0μM、5μM和10μM）处理HT29结肠癌细胞后前述核心通路的活性变化。结果提示,5μM DAC使3条G1/S转换细胞周期相关通路活性增加,而随着DAC浓度增加（10μM）,活性被抑制;随着DAC浓度增加,EMT通路逐步轻度激活,而内源性凋亡通路活性逐渐下降。接着采用两个独立GEO数据集（GSE32323和GSE22598）验证DAC处理HT29结肠癌细胞组（单浓度或多浓度）和对照组之间核心信号通路上关键分子的转录组水平变化。结果提示DAC可不同程度上调E2F介导的细胞周期蛋白E相关G1/S转换、凋亡通路和EMT的关键分子的转录。结论:经DAC处理后,HT29结肠癌细胞系转录组基因转录水平呈上升趋势。共3条信号通路,包括E2F介导的细胞周期蛋白E相关G1/S转换、凋亡通路和EMT信号通路是不同浓度DAC（0μM、5μM和10μM）处理HT29结肠癌细胞后,细胞转录组水平发生变化的核心通路。目的:采用0.1μM DAC体外处理HT29结肠癌细胞,通过RT-PCR和Western blot在RNA和蛋白水平检测DAC处理后HT29细胞G1/S通路、内源性凋亡通路和EMT通路的关键基因的表达变化。材料与方法:选择终浓度0.1μM的DAC稳定培养HT29结肠癌细胞。采用实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测E2F1、E2F3、CCNE1、BCL2、PCNA、FOXC1、VIM、CXCL1、VCAM1的m RNA表达变化,采用蛋白质印迹法（Western blot）检测Cyclin E1、PCNA、Bcl-2、Bax等蛋白的表达变化。连续变量的比较采用t检验。使用Graph Pad Prism 7软件、R 3.5.1软件或SPSS 20.0软件进行分析。P值<0.05提示差异有统计学意义。结果:（1）G1/S转换通路:RT-PCR提示0.1μM DAC可上调HT29结肠癌细胞的E2F1、E2F3和CCNE1的m RNA表达,Western blot提示0.1μM DAC可上调HT29结肠癌细胞Cyclin E1和PCNA蛋白的表达。（2）内源性凋亡通路:RT-PCR提示0.1μM DAC可上调HT29结肠癌细胞的BCL2、PCNA和FOXC1的m RNA表达,Western blot提示0.1μM DAC可上调HT29结肠癌细胞Bcl-2蛋白的表达,并抑制Bax蛋白的表达。（3）EMT通路:RT-PCR提示0.1μM DAC可上调HT29结肠癌细胞的VIM、CXCL1、VCAM1的m RNA表达。结论:体外实验证实低浓度DAC通过激活Cyclin E1激活HT29结肠癌细胞的G1/S转换通路;通过激活Bcl-2蛋白抑制HT29结肠癌细胞的内源性凋亡通路。目的:选择BCL2为例进行研究,对DAC的促癌效果提供新的理论解释。材料与方法:首先比较BCL2 m RNA在肿瘤基因组图谱（The cancer genome atlas,TCGA）结肠癌数据集中癌和癌旁的表达情况,接着通过Oncomine在线数据库对结直肠癌组织和正常组织的BCL2 m RNA的差异表达情况进行meta分析,最后通过亚硫酸氢盐处理后测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）检测低浓度DAC处理后HT29结肠癌细胞的BCL2启动子区的甲基化水平变化。结果:基于TCGA数据库499例结肠癌的转录组数据,发现结肠癌中BCL2m RNA表达低于正常粘膜（14.4±1.1 vs.16.3±0.3,P<0.0001）。基于Oncomine数据库中19个结直肠癌数据集的转录组数据进行meta分析,进一步证实结直肠癌组织中BCL2 m RNA表达低于正常粘膜（P=2.27E-6）。对从MEXPRESS下载的BCL2在TCGA数据库结肠癌数据集中的原始表达矩阵、甲基化位点矩阵和临床信息进行整合,结果提示BCL2启动子区Cp G岛的12个甲基化位点在结肠癌组织中甲基化水平高于正常结肠粘膜组织。针对该BCL2启动子区的Cp G岛进行BSP检测。结果提示,在0.1μM DAC处理后,HT29结肠癌细胞的BCL2启动子区的DNA甲基化率低于对照组（41.1%对57.9%）。结论:BCL2 m RNA在结直肠癌组织中表达低于正常粘膜,启动子区甲基化水平高于正常粘膜。DAC处理HT29结肠癌细胞后其BCL2启动子区的甲基化水平下降。