文昌鱼甲状腺激素/胰岛素样生长因子信号传导通路的证明

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文昌鱼,头索动物,长久以来一直被认为是现存的与脊椎动物进化关系最接近的无脊椎动物,是众所周知的被广泛用来比较种间基因组研究,发育的同源性分析和比较免疫学调查的模式生物。甲状腺激素/胰岛素样生长因子信号途径已确定在所有脊椎动物中都是存在的,但是它的进化起源我们依然不清楚。在过去众多的研究中,已经证明了文昌鱼中存在类甲状腺(内柱)和类肝脏(肝盲囊)的组织,也证明了文昌鱼中存在与脊椎动物类似的甲状腺-肝轴,那么文昌鱼中是否存在原始的甲状腺激素/胰岛素样生长因子信号传导通路?这是本论文主要研究的问题。在佛罗里达文昌鱼和日本文昌鱼中已经克隆出一个编码胰岛素样肽(ILP)的基因,它的氨基酸序列与与胰岛素和胰岛素样生长因子都极为相似。功能研究表明ILP的功能更接近胰岛素样生长因子,因此我们将之重新命名为类胰岛素样生长因子(IGFl)。在本研究的第一部分,我们检测了甲状腺激素(T3)处理后,脊椎动物的实验模式生物—斑马鱼肝脏的IGF-I基因和文昌鱼肝盲囊的IGFl基因的体内体外表达模式,研究结果发现在体外实验中,T3能够提高斑马鱼肝脏IGF-I基因和文昌鱼肝盲囊IGFl基因的表达并呈现剂量依赖性的关系。而且T3诱导的斑马鱼肝脏IGF-I基因和文昌鱼肝盲囊IGFl基因的表达在T3特异性抑制剂DEA的作用下,又明显的被抑制。这些结果都表明T3对IGF-I/IGFl基因的特异性调节作用。当T3浓度为100nM时,在时间依赖性实验中,无论长时期实验(42h)还是短时期实验(8h)斑马鱼肝脏IGF-I基因和文昌鱼肝盲囊IGFl基因的表达在体外组织培养过程中随着T3处理时间的变化表现出相似的模式和趋势。并且在斑马鱼和文昌鱼的体内实验中,T3处理72小时后,斑马鱼肝脏IGF-I基因和文昌鱼肝盲囊IGFl基因的表达明显提高。所有的实验数据都指向一个结果,那就是T3对斑马鱼和文昌鱼IGF基因的调节机制是类似的。这为头索动物文昌鱼中也是存在类似脊椎动物甲状腺激素/胰岛素样生长因子信号途径提供了一个新的证据。在本论文的第二部分,主要是通过检测这四个基因(ACTB,GAPDH,18SrRNA和EF1α)在普通文昌鱼的各个组织以及经过LPS/LTA处理后的文昌鱼组织中的表达水平的变化从而来评估它们作为qRT-PCR内参基因的稳定性。文昌鱼作为处在从无脊椎动物到脊椎动物进化节点位置的模式生物,有很多对这个物种基因的相关研究是通过qRT-PCR技术实现的,在qRT-PCR技术中,需要一个内源性表达恒定的基因作为内参对靶基因的相对表达水平进行标定来修正不同实验状况对结果造成的差异。但是迄今为止却没有关于这个物种内参基因的相关研究。在本论文的第二章,我们使用geNorm和NormFinder这两个软件通过检测普通文昌鱼鱼体、消化道、去消化道鱼体、肝盲囊、腮、后肠、脊索和肌肉中以及经过不同浓度LPS和LTA处理的消化道和去消化道鱼体来评估四个常用持家基因ACTB,GAPDH,18S rRNA和EF1α的表达稳定性。结果显示在未经处理的普通文昌鱼的各个组织中18S rRNA的表达丰度是最高的,而其它三个基因的表达水平彼此接近。其中ACTB的表达是最不稳定的。而后经过不同浓度的LPS和LTA处理后,这四个持家基因的表达出现不同程度的变化,在处理后的文昌鱼的消化道和去消化道鱼体中,这四个持家基因的表达稳定性在不同的实验状况下均有所影响。然而,通过geNorm和NormFinder这两个软件的计算分析一致显示在不同组织中,EF1α基因的变化在四个基因中是最小的,这表明EF1α是适合作为在文昌鱼中qRT-PCR研究的的内参基因。
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