【摘 要】
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威兰胶是一种微生物胞外多糖,由于具有不同于其他微生物多糖的独特的理化特性,近些年来被广泛应用于石油、食品、混凝土加工等行业。本文以Sphingomonas sp.WG基因组测序和预测的威兰胶合成途径为基础,以在威兰胶四糖重复单元组装过程中负责添加第二糖UDP葡萄糖醛酸的糖基转移酶WelK以及对威兰胶的合成和代谢具有调节作用的杂合双组分调节蛋白WelA为研究对象,通过基因敲除、过表达等方式研究了两者
【基金项目】
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国家863计划； 国家自然基金； 山东省自然科学基金；
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威兰胶是一种微生物胞外多糖,由于具有不同于其他微生物多糖的独特的理化特性,近些年来被广泛应用于石油、食品、混凝土加工等行业。本文以Sphingomonas sp.WG基因组测序和预测的威兰胶合成途径为基础,以在威兰胶四糖重复单元组装过程中负责添加第二糖UDP葡萄糖醛酸的糖基转移酶WelK以及对威兰胶的合成和代谢具有调节作用的杂合双组分调节蛋白WelA为研究对象,通过基因敲除、过表达等方式研究了两者在威兰胶合成过程中的作用,为后续通过基因工程方法理性改造菌株,调控威兰胶合成奠定理论基础。本论文研究内容如下:首先,构建了糖基转移酶WelK的敲除株、回补株和过表达株。利用融合PCR的方法构建welK敲除盒,并将其克隆至敲除载体p JQ200SK,获得敲除质粒p JQ200SK-ΔwelK,通过同源重组,构建welK敲除株ΔwelK。扩增welK基因,与载体p BBR1MCS-3连接,构建重组质粒p BBR1MCS-3-welK,将其分别转化ΔwelK和Sphingomonas sp.WG,构建welK回补株ΔwelK/p BBR1MCS-3-welK和过表达株Sphingomonas sp.WG/p BBR1MCS-3-welK。其次,将野生株、welK敲除株、welK回补株进行发酵培养,分析糖基转移酶WelK对威兰胶合成的影响。发酵48 h时,敲除株发酵液黏度同野生株相比降低99.2%,但是,回补株黏度为敲除株的2.5倍,但仅为野生株的1.5%;welK敲除之后,威兰胶产量为1.7 g/L,较野生株降低约71.5%,回补后,产量为敲除株的3.4倍,恢复到野生株的97.4%。说明糖基转移酶WelK对威兰胶的合成起到关键作用。同时,对野生株和welK回补株发酵得到的多糖样品进行了分离纯化及组成分析,结果表明,野生株与回补株所产多糖具有相似的官能团,welK回补株所产多糖的总糖含量及糖醛酸含量均低于野生株,而乙酰基的含量相对于野生株提高约80.7%;在中性单糖组成方面,甘露糖和半乳糖含量有所上升,葡萄糖和鼠李糖含量有所下降。再次,对野生株和welK过表达菌株在低糖浓度（3%）和高糖浓度（6.7%）的培养基中进行了发酵。发酵84 h时,低糖浓度条件下,过表达株产量较野生株提高12.5%,而黏度降低27.1%;高糖浓度下,过表达株黏度较野生株降低57.9%,产量较野生株提高34.1%,最高达到43.13 g/L。说明welK过表达有助于威兰胶产量提高,但是使发酵液黏度降低。此外,对野生株及welK过表达株发酵所得威兰胶组成分析显示,野生株和过表达株所产多糖具有相似的官能团,welK过表达株相较于野生株总糖及糖醛酸含量都有所提高,乙酰基含量较野生株降低约26.5%。表明welK的过表达对威兰胶的结构具有一定的影响。最后,采用同源重组的方法,构建杂合双组分蛋白WelA的敲除株ΔwelA。并通过发酵结果初步分析杂合双组分蛋白对威兰胶合成的影响。WelA敲除之后,发酵液黏度下降99.5%,威兰胶产量下降29.3%,说明WelA在威兰胶的合成过程中起到重要的作用。
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