G蛋白是普遍存在于真核生物细胞中的一个与GTP结合蛋白家族,与膜受体偶联(Heterotrimeric GTP binding proteins),由α,β,γ三个亚基组成异三聚体复合物,分子量100kDa左右。哺乳动物目前发现23种左右的Gα,6种Gβ,14种Gγ蛋白,每个亚基都由多基因编码,从而构成多种多样的可能组合方式。目前已在豌豆、玉米、菠菜、拟南芥、燕麦、大豆、大麦、水稻等多种植物细胞中检测到了G蛋白的存在。植物中G蛋白数目很少,任一G蛋白亚基在各种植物中只有1到2个成员。如拟南芥中只有1个Gα,1个Gβ和2个Gγ。相互作用的只有少数几个蛋白,包括与Gα互作的AtPirinl (PRN1)、prephenatedehydratase1(PD1)、THYLAKOID FORMATION1(THF1)和PLDa1,以及与Gβ互作的N-MYCDOWN-REGULATED1(NDL1)。植物G蛋白的空间结构目前了解极少,主要是参考动物的G蛋白进行推测。Ga亚基有两个独立区域组成,一个区域(GTPase区)含有GTP结合域,这个区域参与GTPase结合。另一个区域即完整的α螺旋区域,它是由一个长的中心螺旋和5个短的螺旋组成,该区域是识别效应物的区段。目前对拟南芥G蛋白的了解很有限,需要进一步研究G蛋白的结构与功能,信号转导机制,及其相互作用因子。因此我们发展了含有连接肽的串联亲和层析技术(命名为TAPa-LP),用以研究拟南芥G蛋白的互作因子,蛋白结构及其生理作用。串联亲和纯化(tandem技术通过靶蛋白质一端嵌入一个特殊的蛋白质标签(TAP tag),不破坏靶蛋白质序列,经过两步连续的亲和纯化获得接近自然条件的特定蛋白质复合体,然后用质谱技术或Edman降解法进行蛋白质鉴定。融合蛋白的功能可能改变或丧失(有的不影响),这也是TAP方法固有的一个缺点,解决的办法是增加一个柔性连接肽,使两边的蛋白质空间结构各自独立,减少干扰。本实验设计的连接肽为GGGGSGGGGGS,核酸序列为GGAGGAGGAGGATCAGGA GGAGGAGGAGGATCA,并构建了5套载体：p2300EC-GPT, p2300EC-GT, p2300EC-QT, p2300EC-QPT和p2300EC-FPT,这5种类型中有3种有连接肽,另2种不含连接肽。TAPa-LP系统揭示了G蛋白在植物的发育过程起着极其复杂的作用。我们发现在叶、茎、花和果实的发育过程中GTP-Ga是一种正调控因子,而GTP-Ga在种子花青素和根的发育过程中为负调控因子。Gaβγ在主根、茎和果实的发育过程是正调控因子,而在叶片的表皮细胞横向增值的过程中起着负调控作用。也就是说在拟南芥发育过程中,GTP-Ga在不同的组织分别发挥4种正调控和2种负调控作用。三聚体Gap丫发挥着3种正调控和1种负调控作用。Gaβγ和GTP-Ga在根和叶的发育中起着相反的调控作用。我们推测·Gaβγ和GTP-Ga的比值影响着或强烈影响植物的生长。在gpal和fpt中GPA1的缺失导致Gapy和GTP-Ga两者均缺失,植物的生长并没有受到明显的影响,这可能是因为G蛋白参与的正负调控的双双缺失造成的。这也说明G蛋白在植物的发育过程中并不是主要的调控元件,可能存在着另外的不为G蛋白参与的调控模式。gpt在T2代的类型中长的高大而粗壮,可能是35S启动子较强的功能提高了Gaβγ和GTP-Ga的含量。qpt在T1代生长健壮但在T2代生长的极其柔弱,主根几乎不再生长,最终是全体死亡。其原因极可能是T1代的激素水平不同于T2种子的水平。看来植物生长的调控不仅依赖于Gaβγ和GTP-Ga的含量,而且也依赖于激素水平,不同的植物激素进行着复杂的植物的生长调控。通过TAPa或linker-TAPa对Ga功能的干涉情况,来判断Ga亚基在空间结构上调控区域所在的空间位置。从实验情况来看,TAPa或linker-TAPa标签有时会影响Ga的功能。Ga的三维结构呈现出两个独立的区域,根据SWISS-MODEL预测的融合蛋白的结构,呈现出三个独立的区域,也就是比Hamm报道的多了TAPa区域。当G、GPT、 QT和QPT中的一种或2种或3种能明显引起拟南芥某种表型发生变化时,调控区域可能定位在C端区域,因为TAPa干扰了G蛋白的功能,靠近C端最有可能的调控区是A stem, I primary root, A primary root, A silique size, I Seed color和A leaf。Gβγ二聚体结合在Ga的N端区域,功能区多在C端。在筛选拟南芥G蛋白α亚基GPA1蛋白互作因子过程中,成功获取了Gγ1和Gβ两个互作因子,并首次获取了完整的G蛋白,从而进一步明确了各亚基之间的相互作用的关系。用改良的含有连接肽或不含连接肽的TAPa纯化系统对融合蛋白空间结构的影响上,可以获取一定的空间结构信息,结合蛋白质空间结构的预测模型和理论,可以探索蛋白质的结构与功能的关系。用改良的含有连接肽或不含连接肽的TAPa纯化系统建立的转基因体系中,可以根据各基因型相同与不同的变化来观察表型的对应变化,从而推知基因可能发挥的某项生理功能。总之,含有连接肽的蛋白纯化系统主要有三个方面的作用：一是其主要的功能就是进行互作因子的鉴定；其次是推知诱饵基因可能的生理功能；三是探知诱饵蛋白的结构信息,这一作用仍是摸索性的,是否可行需要进一步探讨。由于蛋白质空间结构的极端复杂性,科学技术研究手段的局限性(较为常用的方法有x射线晶体衍射方法、NMR等),以及蛋白质预测理论的停止不前,到目前为止,仍然没有大的进展。我们发现了蛋白质在磁场作用后吸光度的变化,根据此变化规律发展了物理学中的光学定律,并试图通过建立数学模型来预测蛋白质的空间结构。单色光通过磁化的蛋白质溶液时,在不同方向所测的吸光度竟然有不同的值,这种现象不符合朗伯-比尔定律。通过实验我们推知蛋白质在磁场中发生了偏转并进行了定向。推导出吸光度A不仅与蛋白质浓度与比色皿内径成正比,而且与蛋白质分子的受光面积成正比,这就大大发展了朗伯-比尔定律(A=K·C·b·SS)。对任何一种蛋白溶液,我们根据新的朗伯-比尔定律,依据MATLAB7.0.1可方便的绘制出蛋白质的三维构象。溶菌酶与牛血清白蛋白的分子形状我们已绘制出来。蛋白质空间结构的研究仍然是当今生命科学的热点和难点。我们发展出一种新的探知蛋白质空间结构的方法,同时也说明磁场对蛋白质确实具有明显的作用,但与当前磁场对细胞或生物体的影响的理论解释不同,这为电磁学对生物的作用机理的探讨提供了一种新的思路。我们相信新的朗伯-比尔定律的运用,在光学、电磁学与分子生物学领域将会具有重要意义。总之,我们发展了TAP-LP纯化系统,对拟南芥G蛋白的复合体进行了成功的纯化,该方法优势在于极大的克服了(仍不能完全克服)以往TAP干扰诱饵蛋白的弊端,提高了成功的可能性。并且发展了物理学中的光学定律(朗伯-比尔定律),通过建立数学模型已成功的预测出BSA和溶菌酶的三维结构。