革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria)感染时,细菌的细胞壁成份-内毒素(endotoxin),或称为脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)被释放入血。释放入血的LPS能广泛作用于免疫细胞产生大量的细胞因子,如肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素6(IL-6)、白介素1(IL-1)、干扰素(INF)、一氧化氮(NO)、血小板活化因子等,即“细胞因子风暴(cytokine storm)",进而引起失控性炎症级联反应,最终引起内毒素休克、组织损伤,严重时可发展为多器官功能障碍(mutiple organ dysfunction)。目前,对于内毒素血症的治疗方案主要有抗生素、抗内毒素抗体、炎性介质拮抗剂、传统中医药以及血液净化等,但均有不足,如疗效并不显著,或副作用比较大。因此,探索和认识内毒素血症的确切发病机制和干预措施,对防治内毒素休克及MODS具有重要的理论意义和实用价值。LPS通过TLR4及其介导的信号通路激活细胞,诱导多种细胞因子的表达。在这些表达产物中,不仅有促炎细胞因子和抗炎细胞因子,还有趋化因子、抗微生物的蛋白、组织修复因子、代谢调控因子和获得性免疫的调控因子。这些产物的功能不同,对组织损伤及内环境的影响也有不同。例如,促炎细胞因子和抗微生物的蛋白对保护性免疫反应来说非常关键,但是,如前所述,持续或过度产生的促炎症细胞因子可导致全身炎症反应及休克,而过度产生的抵抗微生物的蛋白对内环境稳定性影响非常小。所以,为了免受致病菌的感染,在炎症反应过程中需要对基因的表达进行精细的调控,既要控制促炎细胞因子的过度产生,以避免对组织的损伤；又要持续不断地产生抗微生物的蛋白,防止微生物的入侵。然而,这些具有不同功能的基因都受到同一个受体(TLR4)及其介导信号通路的调控,并且还发生在同一种细胞类型(如巨噬细胞)中,因此其调节必然要求下游水平的差异调控,以达到选择性表达或沉默功能相同基因的目的。这一调节不影响受到相同受体诱导的其它基因的激活或抑制,是一种基因特异性的调控。基因的特异性调控主要是在组蛋白修饰水平实现的。组蛋白修饰包括多种修饰方式,如赖氨酸甲基化、乙酰化,丝氨酸磷酸化,泛素化,糖基化等。这些修饰参与调控许多细胞生物学过程,包括基因表达、有丝分裂、细胞分化、X染色体失活以及基因印记等。调控组蛋白修饰的有组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白去乙酰化酶以及这些酶相关的蛋白复合体等。在这些酶及相关蛋白复合体的作用下,组蛋白的修饰发生改变,并可影响高度有序的染色质结构和参与转录调控,这一调节主要体现在：①通过乙酰化/去乙酰化改变组蛋白N端的电荷从而改变组蛋白和DNA的紧密程度；②形成一处有高亲和力的位点,这一位点可以募集到具有局部重构染色质作用的非组蛋白效应蛋白及复合体。对内毒素耐受(endotoxin tolerance)机制的深入研究证实了基因特异性调控这一观点。内毒素耐受是指动物或体外培养的巨噬细胞／单核细胞在给予LPS预处理后,再次给予LPS刺激时对LPS的反应降低,在动物模型中表现为动物死亡率降低,细胞因子如TNFα、IL-6和IL-1的释放减少,但是与抗菌能力相关的分子如内生性致热原增加等；而离体巨噬/单核细胞则表现为LPS引起的补体受体3(complement receptor type3)和FcⅢ/Ⅱ受体表达上调,Cnlp(cathelicidin-related antimicrobial peptide)表达亦增加。由于这两类基因的诱导表达均依赖TLR及其介导的信号通路,因此推测它们的表达是受基因特异(gene-specific)而不是信号通路特异(signal-specific)机制的调控。为了弄清调控这两类功能不同基因的特异性机制,Foster等人按照功能和调节需要,将TLR诱导的基因分为两类。第一类基因,耐受性(tolerizable)基因,在耐受的巨噬细胞受到LPS刺激时不能被再次诱导：第二类基因,非耐受性(non-tolerizable)基因,在耐受的巨噬细胞中仍然可以被诱导。研究发现,耐受性基因包括了多种炎症介质,而非耐受性基因包含了抗微生物因子、病原体识别受体、趋化因子和非直接引起组织损伤的其它基因。进一步研究发现,这两类基因的诱导表达需要不同的组蛋白修饰模式。正常巨噬细胞受到LPS刺激时,上述两类基因启动子区的组蛋白4(H4)均发生了乙酰化,但是只有非耐受性的基因在受到LPS的再次刺激后其启动子部位的H4再次发生了乙酰化。在内毒素耐受的巨噬细胞,非耐受性基因启动子部位组蛋白乙酰化水平的动态变化反映了基因表达水平的变化：即耐受的细胞在受到再次刺激前,与正常细胞相比其非耐受性基因启动子处组蛋白乙酰化的水平保持在相对较高的水平；受到刺激后乙酰化水平进一步升高,甚至升得更快和更高。因此,可耐受性基因和不可耐受性基因其组蛋白的乙酰化状态直接与它们的转录活性相关。上述结果表明炎症细胞是可以通过组蛋白修饰调控特定基因的表达状态,如激活还是沉默。对基因特异性调控的认识,使我们开始反思现有一些抗炎药物治疗效果不佳或者副作用过大的原因。由于过度或持续炎症反应对组织造成的损害主要由炎症介质的过度释放引起,而炎症介质的过度释放与相关信号通路激活有关,因此人们一直把注意力放在如何有效调控信号通路上,即试图通过抑制信号通路控制炎症介质的过度产生,其结果是同时抑制了抗微生物多肽或蛋白质的产生,使病人对感染的易感性增加,并且由于对其他保护反应如代谢和组织修复等的抑制而产生了很大的副作用。所以,探讨组蛋白修饰在基因特异性调控中的作用,不仅有助于阐明内毒素休克及炎症相关性疾病的发病机制,而且为今后寻求更为有效、合理的抗炎药物具有积极的指导作用。基于上述认识,本实验室前期利用蛋白质组学技术分析了小鼠内毒素休克后肝脏组织的核蛋白的变化,结果发现多个组蛋白成员的等电点发生了显著酸化,这些变化多数发生在LPS刺激后的30min和3h时间点。组蛋白等电点的酸化主要与组蛋白的翻译后修饰有关,这些修饰主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等,经过修饰的组蛋白可改变染色质的结构,进而对其下游基因的转录和表达发挥至关重要的作用。因此,本实验的主要目的是研究在内毒素血症中有哪些组蛋白修饰受到影响,探索调控炎症因子转录的组蛋白修饰。据此,本实验分为两个部分：第一部分：检测LPS刺激巨噬细胞后组蛋白H3的K4、K9、K27、K36、 K79,组蛋白H4的K20位点处甲基化以及H3、H4泛乙酰化的变化情况。第二部分：探讨在第一部分实验中变化较明显的修饰是否参与了炎症因子IL-6和TNFα的转录调控。实验结果如下：1.Western Blot实验结果发现,用LPS (100μg/L)刺激巨噬细胞(RAW264.7细胞和BMM细胞)0.5h、1h、2h、3h、6h后,与未刺激对照组(0h)相比,H3K4me2/3、H3K9me2/3、H3K27me2、H3K36me2、H3K79me2、 H4K20me3、H3乙酰化、H4乙酰化都有不同程度的增强,其中,H3K4me2/3和H3K9me2/3增强明显；H3K4me1、H3K9泛甲基化、H4K20me1/2无明显变化。2.由于H3K4me2和H3K9me2在LPS刺激巨噬细胞后0.5h明显增强,故选择这两种修饰位点进行下一步实验。分别用H3K4me2和H3K9me2的抗体富集与H3K4me2和H3K9me2位点结合的DNA(ChIP实验),用荧光定量PCR实验检测与H3K4me2和H3K9me2位点结合的IL-6和TNFa基因启动子的情况。结果显示,LPS(100μg/L)刺激RAW264.7细胞0.5h后,H3K4me2与IL-6和TNFa基因启动子结合增强,分别是对照组的121.8、5.46倍；H3K9me2与IL-6和TNFa基因启动子的结合没有增强。3.为了进一步明确H3K4me2修饰是否参与了IL-6和TNFa的基因转录调控,本实验用组蛋白甲基转移酶抑制剂MTA (5’-Deoxy-tp-(methylthio)adenosine)抑制H3K4me2/3的修饰然后检测其对IL-6和TNFa mRNA水平有无影响。结果发现,用MTA(0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L)预处理RAW264.7细胞后,细胞免疫荧光实验和Western Blot均显示H3K4me2/3修饰受到抑制；进一步用荧光定量PCR检测发现,当H3K4me2/3被抑制后IL-6和TNFa的mRNA水平降低,其中,当MTA预处理浓度为0.5mmol/L时,与单独LPS刺激后相比,IL-6的mRNA水平降低了47%, TNFα的mRNA水平降低了48%；当MTA预处理浓度为1mmol/L时,IL-6的mRNA水平降低了90%,TNFα的mRNA水平降低了78%。IL-6和TNFα mRNA水平的改变具有MTA浓度依赖性。根据以上结果,得到以下初步结论：1.在内毒素血症的发生发展过程中,H3K4me2/3、H3K9me2/3、 H3K27me2、H3K36me2、H3K79me2、H4乙酰化发生了改变,且随着时间的变化而动态变化。H3K4me2和H3K9me2/3在LPS刺激巨噬细胞后增强最明显。2.LPS刺激0.5h后H3K4me2与IL-6和TNFa基因启动子结合增强；进一步用组蛋白甲基转移酶抑制剂MTA抑制H3K4二甲基化和三甲基化后抑制IL-6和TNFa的基因转录,提示H3K4me2参与了炎症介质的转录调控。