线虫全基因组RNAi筛选谷胱甘肽调控相关的基因

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细胞氧化还原平衡的调控与细胞生长、发育、分化以及衰老死亡等过程密切相关。细胞氧化还原状态的调控依赖于众多系统的协同作用,涉及氧化还原平衡的维持、氧化还原敏感的信号通路传导,以及细胞中多种氧化还原敏感的生理进程。氧化还原调控机制是生物学以及医学研究的重要问题,虽然已有一些氧化还原调控基因被发现,但是细胞内源氧化还原平衡如何维持与调控,有哪些基因影响氧化还原平衡还远不清楚,尤其缺乏系统性的研究。  近年来,氧化还原敏感荧光蛋白的应用为这些问题的解答提供了可能。本研究以秀丽隐杆线虫这一经典模式生物为基础,以线粒体为定位区域,使用两种氧化还原敏感探针构建了多个转基因线虫品系,并通过研究对比,成功确立了有效感知氧化还原变化的线虫模型。利用氧化还原敏感探针mt-Grx(1)-roGFP2标记的转基因线虫品系,建立了以L1-L2期为主要检测阶段的筛选方法,并完成了以流式线虫仪为主要检测平台的高通量全基因组RNAi筛选。经过首轮全基因组筛选,我们挑选了变化程度最大的5%的基因进行第二轮的验证筛选,并将第二轮筛选中能够重复且统计样本量较高的基因选定作为候选基因。在获得的118个候选基因中,有文献报道可能与氧化还原相关的基因占到了总体的33%,主要是一些与氧化还原密切相关的调控信号传导、转录调控、代谢等通路的基因,而功能已知,却尚未报道与氧化还原或者与谷胱甘肽调控相关的基因占31%。此外,在候选基因中还包含有36%的功能未知基因,这部分基因中很可能含有参与谷胱甘肽氧化还原调控的新基因。基于全基因组RNAi筛选获得的相关结果,我们对自噬相关基因和谷胱甘肽调控的关系进行了进一步探索。研究发现自噬关键基因下调导致的自噬功能缺陷能够导致谷胱甘肽水平的升高。我们使用不同浓度的GSH耗竭剂马来酸二乙酯(DEM)对野生型及自噬基因突变体线虫进行处理,发现自噬突变体线虫表现出了对DEM更强的耐受能力,而这种耐受能力可能是通过G6PD和SKN-1相关通路的激活所获得的。  本研究首次将线虫、氧化还原敏感探针与高通量检测相结合,完成了全基因组RNAi的筛选,成功获得了参与谷胱甘肽氧化还原调控的候选新基因。本研究使用的筛选策略也为未来以线虫为模式生物,结合其它氧化还原敏感探针的相关筛选提供了很好的参考。
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