研究背景和目的由于肿瘤切除、复杂性外伤、先天畸形等原因造成软组织缺损的修复重建一直是整形美容外科的一大难题,特别是乳房切除术后的乳房再造,更是需要大体积的软组织作为填充物。据报道,世界范围内每年有大约130万人被诊断为乳腺癌,而其中有相当一部分人需要接受不同程度的乳房切除。为了达到乳房再造的目的,现有的技术主要包括皮瓣移植、假体移植以及脂肪移植。然而,通过假体填充实现的乳房再造会产生感染、异物反应及包膜挛缩等问题;自体脂肪,作为一种理想的组织填充剂,已受到越来越多人的青睐,并且已经广泛应用于各种类型的软组织扩增,如乳房再造、丰臀术、丰胸术、腮腺切除术后填充、虽然脂肪获取、处理、移植技术在不断改进,脂肪移植后吸收、坏死、油囊形成、钙化等问题依然使得单纯地依靠脂肪移植技术来实现大体积的软组织扩增成为难题。研究表明,负压吸引可以诱导脂肪组织再生,并且,近几十年来临床中所使用负压吸引器(BRAVA)已被证实可以有效地诱导乳房皮下脂肪组织增长。然而,负压吸引器的临床使用目前依然面临着对脂肪组织扩增不足以及撤离装置后组织体积回缩等问题,限制了这一技术更大范围地推广与使用。目前对于负压吸引器诱导脂肪组织扩增的实验研究表明,负压吸引器作用于皮肤后能够使皮下组织产生炎症、水肿及机械张力,于此同时,这些因素作用于皮下脂肪组织中的脂肪来源干细胞并诱导其成脂分化,进而促进了脂肪组织的再生。近几年有关脂肪移植的研究也表明脂肪来源干细胞是脂肪移植后脂肪再生重要的细胞来源并且移植后的脂肪组织的长期保存与组织中脂肪来源干细胞的数量有密切关系。以上研究结果表明,脂肪来源干细胞的数量与脂肪再生过程密切相关。因此,我们思考,预先增加脂肪组织中的脂肪来源干细胞的数量,再辅以负压吸引能否产生更好的脂肪再生的结果?研究表明,正常机体组织内,细胞与细胞间相互接触连接形成稳态,并且这一过程受细胞的接触抑制及Hippo/YAP通路调控。我们猜想,解除脂肪组织中细胞间的接触可以诱导脂肪来源干细胞的增殖,增殖后的脂肪来源干细胞在负压吸引的诱导下成脂分化,进而产生大体积的脂肪组织。围绕这一猜想,我们分别建立体内体外两个互补的实验体系来进行验证。在体外,我们准备不同密度的脂肪来源干细胞来探究不同程度的细胞间接触对细胞增殖的影响;在体内,我们利用球囊扩张技术对脂肪组织进行钝性分离以解除脂肪组织内细胞间接触并辅以负压吸引以维持组织分离状态。钙粘素调节的细胞与细胞接触是一个高度受调控的过程,其主要影响着YAP蛋白在核内的表达。当细胞处于低密度的增殖状态时,YAP蛋白主要位于细胞核内,当细胞处于高密度的静止状态时,YAP蛋白则主要位于细胞质内。我们将进一步通过检测体内外细胞内钙粘素及YAP蛋白的表达来进一步评估脂肪组织分离对脂肪组织内脂肪来源脂肪来源干细胞增殖状态的影响。方法1、不同密度的脂肪来源干细胞对其增殖状态的影响。在体外培育不同密度的脂肪来源干细胞(19%,36%,75%,及93%融合度),观察细胞增殖状态与其密度的关系并检测YAP蛋白及钙粘素的表达,探究不同程度的细胞间接触对细胞增殖及细胞接触抑制状态的影响。2、脂肪组织分离结合负压吸引诱导脂肪组织再生组织利用球囊分离技术对脂肪组织进行钝性分离,检测脂肪组织内钙粘素及YAP蛋白表达及脂肪来源干细胞增殖状态变化,探究脂肪组织的钝性分离是否能够解除脂肪组织内细胞间接触抑制并诱导脂肪组织内脂肪来源干细胞增殖,并在负压吸引的作用下观察不同时间点脂肪组织再生情况。4、统计学分析所有数据以均数±标准差(x±SD)表示,使用统计软件SPSS 21.0进行数据处理并且使用GraphPad Prism 6进行数据处理作图。两组之间比较采用配对t检验;不同时间点的差异采用方差分析。结果1、在体外培养体系中,低脂肪来源干细胞的密度相较于高细胞密度有着更高的细胞增殖率,并且相较于高密度状态下的脂肪来源干细胞,低密度状态的细胞钙粘素表达降低,YAP蛋白表达升高,表明低密度状态下的脂肪来源干细胞间接触抑制解除并诱发细胞增殖,而高密度状态下细胞间相互接触抑制,细胞处于静止状态。2、对脂肪组织进行钝性分离后,在不同时间点检测脂肪组织内钙粘素和YAP蛋白表达情况。相较于对照组,分离组中钙粘素在第一周时有着较低的表达水平,而在随后的时间中其表达逐渐升高。而YAP蛋白的表达在组织分离后的第一周有着较高的表达,而随后逐渐降低。在组织分离早期,脂肪组织中出现大量Ki67表达阳性细胞及小体积脂肪细胞,我们的体外实验同样有着类似的变化趋势。这一结果表明对脂肪组织进行钝性分离可解除细胞间的接触抑制并引发脂肪组织内脂肪来源干细胞大量增殖,并且这一过程很可能受接触抑制解除及Hippo/YAP通路激活影响。讨论目前,许多实验将干细胞种植到支架或细胞外基质中并植入到体内以构建工程化的脂肪组织。然而,目前使用这些细胞的主要限制因素为准备细胞过程中所涉及的安全性问题。如细胞消化的酶解过程可能改变细胞的生物学性质并且这一过程不符合最小操作原则。同时,单独注射游离的细胞常引起难以预估的细胞的迁移结果(例如:异位纤维化及淋巴结肿)。因此,如果脂肪组织本身的脂肪来源干细胞能够得到扩增并用于脂肪再生将会是非常有意义的事情。我们课题中所使用的球囊分离技术是一种全新的用来机械分离脂肪组织的方式,并且被证实能够有效地诱导脂肪组织内的脂肪来源干细胞的增殖。由Morrison团队提出的”脂肪组织工程室技术”证实单纯使用组织工程小室可以诱导小室内脂肪瓣中脂肪来源干细胞的增殖,然而,由于工程室的植入所引起的严重的异物反应及包膜形成被认为是限制工程室内后期脂肪组织进一步增长的重要原因。研究表明,物理因素,例如空间限制/细胞与细胞的接触或者局部组织的机械性质能够调控细胞的增殖。组织中的细胞是通过细胞间钙粘素结合而相互连接,细胞间的接触抑制在正常情况下是处于持续的激活状态,并且其接触抑制的解除常诱导细胞从静止状态转变成增殖状态。细胞间接触抑制的解除诱导的细胞增殖特点是细胞核内YAP蛋白的高表达及Hippo/YAP通路的激活。我们的体外研究表明,脂肪来源干细胞在低密度状态下能够激活Hippo/YAP通路但在高密度状态下抑制该通路的激活。我们同样在体内结果中观察到类似的钙粘素、YAP蛋白表达及脂肪来源干细胞增殖状态的动态变化,这表明本模型中脂肪组织分离能够解除组织间细胞的接触并诱导脂肪组织内脂肪来源干细胞的增殖,并且这个过程很可能是受细胞间接触抑制的解除及Hippo/YAP通路激活的影响。负压吸引器对机体所产生的影响已被研究多年。研究表明,负压吸引器可以产生机械性刺激并诱导皮下水肿、缺血及炎症反应,而这些因素被认为能够产生并维持成脂微环境并诱导脂肪再生。炎症与成脂有密切的关系,研究表明炎症能够上调proliferator-activated receptor-γ(PPARγ)表达同时募集脂肪来源干细胞形成新的脂肪组织。Lancerotto等人的研究表明外组织扩增器作用2小时后的组织会呈现出胶明显的炎症浸润并且该炎症反应可持续2天。因此,我们认为,炎症是我们的模型中由负压吸引而产生的其中一个诱导成脂因素。水肿是临床或实验中常见到的由负压吸引器产生的结果。同样,在实验早期我们在组织样本可以观察到大量的胶原渗出。研究表明,在患者收水肿影响的身体部位常出现脂肪组织形成,并且由淋巴水肿组织中分离出的脂肪来源干细胞有更多的成脂基因表达及更强的成脂分化能力。本实验中,在脂肪组织构建早期同样能够观察到大量的水肿及胶冻样渗出,提示水肿可能参与到了促进脂肪再生的过程中,并且脂肪组织中成脂可由PPARy基因表达及成熟组织中小脂肪细胞的出现而确认。与此同时,由外组织扩增产生的机械刺激亦可影响成脂过程。体外研究证实持续性的机械张力能够促进脂肪细胞中脂质聚集同样也可以诱导脂肪前体细胞的成脂分化。本实验模型中所采用的外组织扩增器能够机械性通过负压吸引刺激并拉伸脂肪组织,产生持续的稳定的张力,其可能最终促进成脂过程。结论1、脂肪组织的钝性分离可以解除脂肪组织中细胞间接触并诱导脂肪组织中脂肪来源干细胞增殖,而这一过程受细胞间接触抑制的解除及Hippo/YAP通路激活调控。2、在负压吸引器的作用下,脂肪组织中增殖后的脂肪来源干细胞进行成脂分化,进而产生大体积的脂肪组织。