克罗诺杆菌属(Cronobacter spp.)是一种极具污染风险的食源性致病菌,经常污染婴儿配方乳粉(powdered infant formula,PIF)及加工环境,可导致婴幼儿感染脑膜炎、菌血症等疾病,并具有极高的致死率。克罗诺杆菌在自然界中分布的广泛性及较强的环境适应能力,使其成为污染PIF的主要原因。克罗诺杆菌属具有丰富的遗传多样性,其种群特征在具有普遍性的同时也具有特殊性,即不同生境下的克罗诺杆菌的种群结构及遗传物质存在差异。在先前的工作中,本团队对分离自我国PIF及其加工环境中的克罗诺杆菌进行了群体结构及环境耐受相关研究,结果表明分离菌株与世界其他地区相比具有独特的种群特征,且不同序列型(sequence type,ST)菌株的耐受能力差异明显。为了进一步探索克罗诺杆菌遗传特征与环境适应的机制,挖掘菌株功能基因以及该属种间和种内遗传特点,揭示其遗传进化规律。本研究选取15株分离自PIF及其加工环境中的不同ST菌株进行de novo测序,同时从NCBI中下载已完成完成图测序的12株克罗诺杆菌作为参考菌株,共27株菌株进行克罗诺杆菌属的比较基因组分析。本研究主要内容及结果如下:(1)采用Illumina HiSeq 2500测序平台对15株克罗诺杆菌的全基因组进行测定,并通过SOAP denovo拼接获得框架图序列。结果表明,克罗诺杆菌基因组大小范围在4.34-4.57Mb,平均GC含量为56.88%,编码DNA序列(coding DNA sequence,CDS)4042个,tRNA数量在70-87之间,参考菌株rRNA数量均为22,测序菌株数量不及5个。同时使用Mauve2.3.1软件分别对克罗诺杆菌属内七种标准菌株种间及阪崎克罗诺杆菌种内基因组进行共线性分析。结果发现,共有4411个局部共线块,克罗诺杆菌属种间并没有发生大规模插入、缺失、倒位等现象,而阪崎克罗诺杆菌种内共线性较差,出现大规模基因组重排事件。(2)利用Jspeceis软件基于blast运算分析27株克罗诺杆菌基因组的平均核苷酸一致性分析(average nucleotide identity,ANI)。结果发现测序菌株CE13、CE15、CE16、CE28、CE29、CE32、CE52、CE55、CE56、CE56、CE62、CE63、CE64、CE65、CE75与5株C.sakazakii参考菌株,CMa与3株C.malonaticus参考菌株之间的ANI值均大于97%,而与其他5个物种菌株的ANI值均小于95%,结果表明,测序菌株可分别归属于阪崎及丙二酸盐克罗诺杆菌两个物种。可见基于全基因组序列平均核苷酸一致性计算是一种准确且有效的菌种判定方式,可用于克罗诺杆菌属的鉴定。(3)根据PGAP聚类分析数据,采用PanGP软件绘制27株克罗诺杆菌基因组稀释曲线。结果发现其泛基因组属于开放型,表明菌株间在选择压力下遗传物质交流频繁,暗示其基因库多样性较高。同时随着基因组数量的增多,大量新基因不断被发现,进一步说明克罗诺杆菌基因组具有高度的可塑性。同时利用Roary软件通过比较基因组学的方法定义27个克罗诺杆菌的泛基因组,并通过COG数据库进行功能注释。结果发现,27株克罗诺杆菌基因组划分成11262个直系同源簇,其中特有基因占总基因簇的43%。三类基因在26类功能分类中均有富集,表明克罗诺杆菌各项功能是由整体遗传物质统筹调控的。(4)通过比较克罗诺杆菌属种间基因组发现阪崎克罗诺杆菌物种特有基因包括编码外源唾液酸吸收和利用基因簇nanKCATE、自转运蛋白icsA、毒素-抗毒素系统生物膜蛋白tabA、蛋白酶htpX、鸟苷环化酶dosC、肽链内切酶mepS、S菌毛黏附蛋白sfaS前体、DNA连接酶B ligB、亮氨酸特异性结合蛋白前体livK、HTH-型转录调节因子lutR和leuO等44个毒力相关基因及20个假定蛋白。ST1菌株包括亚碲酸盐抗性基因簇terBDZWXY、血管性血友病因子a型结构域蛋白等特异毒力基因区域及13个假定蛋白。ST4菌株特异基因包括毒力因子ypjF、原噬菌体cps-53整合酶及19个假定蛋白。而ST8菌株并未发现特异毒力因子。(5)采用BLASTP程序将27株克罗诺杆菌的蛋白序列分别比对抗性基因CARD数据库中的同源蛋白模型序列,获得抗生素抗性基因。结果发现27株克罗诺杆菌共包含134个抗生素本体(Antibiotic Resistance Ontology,ARO),主要含有抗生素抗性基因、多重耐药基因簇、多重外排系统及其调控因子。聚类分析表明菌株所携带耐药基因没有明显差异,且进化距离较近物种更为贴近。(6)应用PhyML程序及Mega软件分别完成基于全基因组,16S rDNA及持家基因串联序列的系统发育树构建。结果表明克罗诺杆菌属目前已经分化为C.muytjensii-C.dublinensis以及C.muytjensii-C.turicensis-C.sakazakii-C.malonaticus两大分支。前者主要进化为更适应于环境与植物结合的生态位群体,后者主要在进化中获取与毒力及宿主适应性相关等附属基因,从而增加致病能力。(7)应用ClonalFrameML及CODEML程序确定27株克罗诺杆菌核心基因组的重组区域及进化选择方向。结果发现27株克罗诺杆菌的核心基因组中均有重组事件发生,且均经历纯化选择。同时应用ISFinder及IslandViewer软件对27株克罗诺杆菌基因组中IS及GI进行预测,结果表明大量IS的分布可能是在选择压力下通过转座而形成的,而部分菌株GI中T6SS基因簇与柠檬酸杆菌中cts1簇同源的现象也进一步证实克罗诺杆菌基因组中水平基因转移事件发生的事实,从而增加该物种的遗传多样性及较强的环境适应能力。通过本研究,从基因层面剖析克罗诺杆菌遗传进化特征,使基因研究服务于生产实际,为PIF及婴儿食品中克罗诺杆菌的监测、有效防控和诊断治疗提供理论基础及新思路。