研究背景及意义：支气管哮喘(简称哮喘)是目前最常见的一种影响人类健康的慢性气道炎症性疾病之一,据研究,全球每20人中就有1人患有哮喘,近年来我国哮喘患病率也在持续增长。哮喘的发病主要是基因与环境复杂的相互作用的结果,目前具体机制仍然不明。因此,现在对哮喘的治疗仍以控制症状为主。但是,多项研究均表明,尽管大部分诊断明确的患者在规范化治疗后症状能够得到有效控制,却仍无法逆转哮喘的自然病程,最终发展为不可逆的气道重塑。因此探讨哮喘发病机制、寻找新的防治靶点是呼吸专业未来必须攻克的重大课题。随着研究的不断拓展和深入,目前认为气道上皮细胞(AEC)不仅在维持气道内环境的平衡和稳定中发挥重要的作用,还在哮喘气道炎症的启动和维持中扮演关键角色。AEC在气道腔面形成一个结构完整的屏障,后者是气道抵御外界损伤因素的第一道屏障。其屏障功能的结构基础是气道上皮细胞间的紧密连接结构。有研究表明：在哮喘患者中,气道上皮细胞紧密连接及粘附连接蛋白的表达量较正常人减少。气道上皮结构及屏障功能的破坏,一方面使AEC处于应激状态,通过分泌炎症介质触发Th2型炎症反应；另一方面可直接导致外界过敏原轻易地通过气道壁粘膜,与树突状细胞(DC)等免疫细胞接触,使机体致敏。甲苯二异氰酸酯(Toluene Diisocyanate, TDI)是一种常见的工业原料,由于价格低廉,广泛用于生产软质聚氨酯泡沫及聚氨酯弹性体、涂料、胶黏剂等,是最常见引起哮喘的过敏原。长期暴露于TDI环境的人群,最终约有5%-15%发展为哮喘。由于其在建筑、家居等各种室内外装修中的广泛应用,在普通人群中,TDI哮喘的发病率也高达0.1%-8%。鉴于其导致的巨大社会和经济负担,TDI哮喘已引起高度重视。TDI作用于人体的重要靶点是AEC。体外实验发现,气道上皮屏障可被TDI破坏,高浓度的TDI处理可致气道上皮细胞紧密连接及缝隙连接蛋白解体、细胞核固缩、碎裂,气道上皮细胞单层电阻改变甚至细胞的死亡。我们实验室既往研究也表明：TDI-人血清白蛋白(HSA)复合物在不影响细胞活力的情况下,可引起人支气管上皮细胞系(16HBE14o-)细胞通透性的增加,屏障功能受损,该改变与TDI-HSA促进16HBE14o-细胞ERK通路活化及破坏气道上皮细胞粘附连接蛋白E-钙粘蛋白分布有关。1,25(OH)2D3是维生素D的生物活性代谢产物,其发挥生物学效应主要依赖维生素D受体(Vitamin D receptor, VDR)。研究表明,除了调节机体的钙和磷代谢,维生素D水平(25(OH)D)还与哮喘发生呈负相关,与吸入激素治疗的疗效呈正相关。维生素D对哮喘保护作用的相关机制已经发现的有：1,25(OH)2D3可促进AEC分泌抗菌肽,增强机体固有免疫；抑制DCs成熟,诱导免疫耐受；促进调节性T细胞分化,抗炎因子IL-10分泌,调节Th1/Th2平衡；抑制被动致敏的气道平滑肌增殖及基质金属蛋白酶(MMP-9)分泌,防止哮喘气道重塑等。近期研究还表明,维生素D还可增加肠上皮、角膜上皮等的细胞间紧密连接蛋白表达,起保护屏障功能的作用。但是维生素D是否对支气管上皮细胞也具有同样的作用,维生素D可否保护支气管上皮免受外界有害损伤,这可能为维生素D对哮喘的保护作用增加新的机制,同时为哮喘治疗提供新的靶点。本实验组已经在前期体外实验中证明TDI-HSA可引起人支气管上皮屏障功能受损,并在体内实验中证实维生素D可减轻TDI哮喘小鼠气道炎症。在此基础上,我们拟在体外TDI模型下进一步探索,1,25(OH)2D3预处理对气道上皮屏障功能是否有保护作用,并探讨可能的作用机制。研究材料与方法：1、甲苯二异氰酸酯(TDI)、分析纯的1,25(OH)2D3、异硫氰酸萤光素-右旋糖酐(FITC-Dx)均购自美国Sigma-Aldrich公司,人支气管上皮细胞系16HBE14o-购白上海复祥生物有限公司,E-钙粘蛋白的多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,ERK信号通路相关抗体购自美国CST公司,兔抗人GAPDH多克隆抗体、羊抗兔二抗、牛血清白蛋白组分V (BSA)等购自北京中杉金桥公司,Bradford法蛋白检测试剂盒购自BIO-RAD公司。2、制备TDI-HSA抗原结合物：应用改良的Son M方法制备TDI-人血清白蛋白结合物(TDI-HSA)。应用改良的Son et al.’s assay方法测定复合物中TDI及HSA的结合比。3、人支气管上皮细胞系16HBE14o-细胞的培养。将16HBE14o-细胞接种在含10%胎牛血清的1640培养基中,置于37-C恒温的5%CO2孵箱培养,每2天更换培养液1次。待细胞生长至90%融合后,用0.25%胰酶消化5-7min,用含10%胎牛血清的1640培养基终止消化。收集含细胞的消化液,在室温下800r/min离心2min,弃去上清并重悬沉淀,将细胞按实验需要的密度接种于所需培养皿中,用于下一步实验。所有实验均使用3-10代以内的支气管上皮细胞,以避免细胞老化带来的影响。4、四唑盐(MTT)比色法检测不同浓度1,25(OH)2D3、TDI-HSA、ERK通路抑制剂U0126对16HBE14o-细胞活力的影响。分组情况：正常对照组、1,25(OH)2D30.1nM组、1,25(OH)2D31nM组、1,25(OH)2D31OnM组、1,25(OH)2D3100nM组,TDI-HSA20ug/mL组、TDI-HSA60ug/mL组、]TDI-HSA100ug/mL组、TDI-HSA140ug/mL组,ERK通路抑制剂5uM组、ERK通路抑制剂10uM组、ERK通路抑制剂15uM组、ERK通路抑制剂20uM组、ERK通路抑制剂25uM组按上述分组刺激16HBE14o-24h(1,25(OH)2D3刺激48h1后,检测细胞活力。5、观察1,25(O均2D3预处理对TDI-HSA所致的16HBE14o-屏障功能受损是否具有保护作用。实验分组：正常对照组、单纯1,25(OH)2D3组(10nM)、单纯HSA组(100ug/mL)、TDI-HSA处理组(100ug/mL)、不同浓度(0.1nM、1nM、10nM、100nM)、不同预处理时间(0h、6h、12h、24h)的1,25(OH)2D3预处理组。跨细胞电阻测定(TER)及异硫氰酸萤光素-右旋糖酐透过率(FITC-Dx)用于研究单层16HBE14o-细胞屏障功能的变化;免疫印迹(western blotting)及免疫荧光(immunofluorescence)分别用于研究E-钙粘蛋白表达及分布变化。6、观察ERK通路抑制剂U0126预处理对TDI-HSA所致的16HBE14o-屏障功能受损是否具有保护作用。实验分组：正常对照组、TDI-HSA处理组(100ug/mL)、1,25(OH)2D3预处理组(10nM预处理24h)、ERK通路抑制剂预处理组(25uM预处理1h)。跨细胞电阻测定(TER)及异硫氰酸萤光素-右旋糖酐透过率(FITC-Dx)用于研究单层16HBE140-细胞通透性的变化；免疫印迹(western blotting)及免疫荧光(immunofluorescence)分别用于研究E-钙粘蛋白表达及分布变化。7、观察TDI-HSA处理后,16HBE14o-细胞ERK通路的活化情况及1,25(OH)2D3预处理对其干预作用。实验分组：正常对照组(不加TDI-HSA,只以无血清培养基孵育),HSA100ug/mL组,TDI-HSA100ug/mL组,1,25(OH)2D3预处理组(10nM,预处理6h),按上述刺激分组后,分别于刺激10min及15min时收取细胞,western blotting法检测p-ERK及t-ERK表达水平。8、统计学方法：采用SPSS13.0统计软件分析,计量资料用均数士标准差表示,方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析(one-way ANO VA),各组间多重比较采用LSD法,方差不齐时,总体均数的比较采用Welch法,各组间多重比较采用Tamhane’s T2检验,以P<0.05具有统计学意义。结果：1、不同浓度的1,25(OH)2D3对16HBE14o-细胞活力影响：1,25(OH)2D3在100nM及以下浓度对细胞活力无显著影响(P>0.05)。2、不同浓度的TDI-HSA对16HBE14o细胞活力影响：当TDI-HSA浓度达到140ug/mL后,细胞活力显著下降,具有统计学差异(与对照组相比,P<0.01)。3、不同浓度的ERK通路抑制剂U0126对16HBE14o-细胞活力影响：ERK通路抑制剂在25uM及以下浓度对细胞活力无显著影响(P>0.05)。4、1,25(OH)2D3预处理对TDI-HSA所致的16HBE14o-细胞屏障功能受损的作用：跨细胞电阻值(TER)显示：TDI-HSA处理24h后,细胞跨细胞电阻显著下降(与HSA组对比,P<0.01),异硫氰酸萤光素-右旋糖酐透过率(FITC-Dx)显示：TDI-HSA处理24h后,FITC-Dx透过率显著升高(与HSA组相比,P<0.01)。免疫荧光显示：在正常对照组及HSA组中,E-钙粘蛋白沿细胞膜连续分布于细胞间连接处,TDI-HSA (100ug/mL)处理24h后,细胞间连接处E-钙粘蛋白的完整性遭到破坏,向胞浆中弥散增多。不同浓度(0.1nM、1nM、10nM、100nM)、不同预处理时间(Oh、6h、12h、24h)的1,25(OH)2D3预处理后,TER。明显回升(0.1nM、1nM、10nM、100nM与TDI-HSA组相比,P<0.01,且10nM、100OnM与1nM组相比,P<0.01；预处理Oh、6h组与TDI-HSA组相比,P<0.05,预处理12h、24h组与TDI-HSA组相比,P<0.01)；FITC-Dx透过率明显降低(1nM、10nM与TDI-HSA组相比,P<0.01；预处理0h、6h、2h、24h与TDI-HSA组相比,P<0.01；其中,预处理12h、24h与预处理6h组相比,P<0.01),immunofluorescence显示：E-钙粘蛋白分布改变显著逆转。E-钙粘蛋白总的表达水平在各组间无显著差异。5、ERK通路抑制剂U0126预处理对TDI-HSA所致的16HBE14o-屏障功能受损的影响：ERK通路抑制剂(25uM)预处理1h后,TER明显升高(与TDI-HSA组相比,P<0.01),FITC-Dx透过率显著降低(与TDI-HSA组相比,P<0.05),immunofluorescence显示：E-钙粘蛋白分布改变明显逆转。6、TDI-HSA处理后,16HBE14o-细胞ERK通路的活化情况及1,25(OH)2D3对其干预作用：TDI-HSA100ug/mL刺激16HBE14o-10min及15min后,可见p-ERK表达水平显著增高,尤其以10min时的作用最显著。1,25(OH)2D3预处理组(10nM,预处理6h)在15min时可显著抑制TDI-HSA所诱导的p-ERK活化。结论：1,25(OH)2D3显著逆转TDI所致的人支气管上皮细胞单层屏障功能受损,此作用与其抑制16HBE14o-细胞ERK通路活化有关。