【摘 要】
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目的:探讨α-1,6岩藻糖基转移酶(α1,6-fucososyltransferase 8,FUT8)对嘌呤霉素氨基核苷(puromycinaminonucleoside,PAN)致小鼠足细胞损伤的影响。方法:33℃条件下用添加小
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目的:探讨α-1,6岩藻糖基转移酶(α1,6-fucososyltransferase 8,FUT8)对嘌呤霉素氨基核苷(puromycinaminonucleoside,PAN)致小鼠足细胞损伤的影响。方法:33℃条件下用添加小鼠γ-干扰素(interferon-γ,γ-IFN)的细胞培养基体外培养永生化小鼠足细胞系(mousepodocyteclone5,MPC5),并在37℃条件下用不含小鼠γ-IFN的细胞培养基培养10-14天诱导其分化。1.实验分组:将分化成熟的MPC5细胞随机分为六组:(1)正常组(Control):细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养;(2)阴性对照组(Mock):终浓度为33nM乱序siRNA转染24小时;(3)PAN组(PAN):终浓度为5 ug/ml的PAN孵育2小时;(4)PAN加FUT8siRNA干扰组(PANF):终浓度为33nM FUT8siRNA转染24小时后加入浓度为5ug/ml的PAN孵育2小时;(5)PAN加阴性对照组(PANM):终浓度为33nM乱序siRNA转染24小时后加入浓度为5 ug/ml的PAN孵育2小时;(6)FUT8siRNA 干扰组(FUT8siRNA):终浓度为 33nM 的 FUT8siRNA 孵育 24 小时。2.用倒置相差显微镜观察各组细胞形态,荧光实时定量PCR方法测定各组细胞FUT8mRNA的表达,免疫荧光方法测定各组细胞表面核心岩藻糖链和足细胞特异标志物Nephrin的表达,免疫印迹方法测定各组FUT8、Nephrin的蛋白表达,流式细胞术测定各组细胞凋亡,用单因素方差分析进行统计学处理。结果:1.免疫荧光显示MPC5细胞上存在中等量核心岩藻糖链表达。2.与正常对照组相比,5ug/ml的PAN孵育MPC5细胞2小时后,细胞的胞体缩小,足突回缩,部分细胞从培养皿底脱落;免疫荧光结果显示细胞表面核心岩藻糖链的荧光强度增加,Nephrin的荧光强度降低;免疫印迹结果显示FUT8表达水平升高,Nephrin的表达水平降低;流式细胞术结果显示细胞凋亡数增加。FUT8siRNA转染后PANF组与PAN组相比,从培养皿底脱落细胞数明显减少,MPC5细胞表面核心岩藻糖链和FUT8的表达降低,Nephrin蛋白表达量增多,细胞凋亡数减少。结论:1.核心岩藻糖基化修饰参与了嘌呤霉素氨基核苷诱导的小鼠足细胞凋亡和结构蛋白的改变。2.应用RNA干扰技术沉默FUT8基因,阻断足细胞的核心岩藻糖基化修饰,能在一定程度上抑制嘌呤霉素氨基核苷诱导的小鼠足细胞损伤。
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