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放射治疗是临床治疗宫颈癌的有效手段之一,但常因辐射敏感性不理想而导致治疗效果不佳。近年来,由于分子生物学的发展和肿瘤细胞对放疗耐受机制的研究,发现某些基因的表达能在分子水平上影响肿瘤细胞的放射敏感性进而影响电离辐射诱导的肿瘤细胞死亡。大量研究证实电离辐射能诱导肿瘤细胞自噬,而自噬既可以作为一种适应性反应保护肿瘤细胞对抗不利环境,也可以作为Ⅱ型程序性死亡方式发挥抗肿瘤作用。热休克蛋白90α(HSP90α)是保护蛋白质稳定表达及功能活性的分子伴侣,抑制HSP90α活性可以诱导其底物蛋白降解。脱氧胞苷激酶(d CK)是脱氧核苷酸生物合成补救途径中的关键酶。研究表明si RNA特异性阻断d CK的表达可以提高宫颈癌对辐射的敏感性。本研究着重探讨Hela细胞中HSP90α/d CK在电离辐射诱导自噬性死亡中的作用。目的以He La细胞(人宫颈癌细胞株)为研究对象,探讨HSP90α/d CK在电离辐射诱导自噬性死亡中的作用及其可能的机制,以期为宫颈癌的临床放射治疗提供潜在的治疗靶点。方法(1)细胞株:本研究选用人宫颈癌细胞株He La为研究对象;(2)照射条件:采用X-RAD 320ix辐照仪进行照射,电压180k V,电流20 m A,滤板2 mm Al,单次源靶距70 cm,剂量率1.0 Gy/min;(3)磷酸钙共沉淀转染法构建HSP90αRi、d CKRi和AKTRi细胞模型,脂质体转染法构建AKT过表达细胞模型;(4)蛋白的表达变化采用Western blot检测;(5)细胞自噬率采用流式细胞术检测;(6)细胞存活率采用MTT检测;(7)蛋白质之间的相互作用采用细胞免疫荧光染色和Co-IP检测;(8)SPSS软件进行统计学分析,均值比较采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.电离辐射诱导He La细胞自噬性死亡并降低HSP90α的表达Western blot结果显示,与假照组比较,8 Gy照射组P62的表达明显降低、LC3Ⅱ/LC3Ⅱ比值明显升高、HSP90α的表达明显降低。流式细胞术结果显示,8Gy照射组细胞自噬率明显高于假照组(P<0.05)。MTT结果显示,72h后8 Gy照射组细胞存活率明显低于假照组,CQ处理后明显抑制电离辐射诱导的细胞死亡(P<0.05)。2.HSP90α在电离辐射诱导He La细胞自噬性死亡中的作用构建HSP90αRNAi细胞模型。(1)Western blot检测24 h后P62和MAPLC3的表达:与相同处理的空载体p SUPER组比较,HSP90αRi组P62的表达明显降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅱ比值明显升高。与假照组比较,8 Gy照射组P62的表达在空载体p SUPER细胞模型中降低19.58%,在HSP90αRi细胞模型中降低97.58%;与假照组比较,8 Gy照射组LC3Ⅱ/LC3Ⅱ比值在空载体p SUPER细胞模型中升高23.38%,在HSP90αRi细胞模型中升高47.04%。(2)流式细胞术结果显示:与假照组比较,8 Gy照射组自噬率在空载体p SUPER细胞模型中升高43.40%;在HSP90αRi细胞模型中升高55.92%(P<0.05)。(3)MTT检测72 h后细胞存活率:与假照组比较,8 Gy照射组细胞存活率在空载体p SUPER细胞模型中降低19.29%;在HSP90αRi细胞模型中降低31.24%(P<0.05)。以上结果表明,沉默HSP90α明显促进电离辐射诱导的He La细胞自噬性死亡。3.d CK在电离辐射诱导He La细胞自噬性死亡中的作用构建d CKRNAi细胞模型。(1)Western blot检测24 h后P62和MAPLC3的表达:与相同处理的空载体p SUPER组比较,d CKRi组P62的表达明显降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高。与假照组比较,8 Gy照射组P62的表达在空载体p SUPER细胞模型中降低38.60%,在d CKRi细胞模型中降低41.11%;与假照组比较,8 Gy照射组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值在空载体p SUPER细胞模型中升高22.24%,在d CKRi细胞模型中升高23.74%。(2)流式细胞术结果显示:与假照组比较,8 Gy照射组自噬率在空载体p SUPER细胞模型中升高21.23%;在d CKRi细胞模型中升高60.21%(P<0.05)。(3)MTT检测72 h后细胞存活率:与假照组比较,8 Gy照射组细胞存活率在空载体p SUPER细胞模型中降低19.29%;在d CKRi细胞模型中降低28.83%(P<0.05)。以上结果表明,沉默d CK明显促进电离辐射诱导的He La细胞自噬性死亡。4.He La细胞中HSP90α和d CK相互作用维持AKT的表达在He La细胞中,细胞免疫荧光染色检测发现HSP90α和d CK共定位表达;Co-IP检测发现HSP90α和d CK结合且8 Gy照射降低两者间的结合。沉默HSP90α明显降低d CK的表达及活性。HSP90α和AKT共定位表达,沉默HSP90α和沉默d CK均明显降低AKT的表达。以上结果表明,d CK可能是HSP90α的底物蛋白,二者相互作用共同维持AKT的表达。5.AKT在电离辐射诱导Hela细胞自噬性死亡中的作用先构建AKTRNAi细胞模型,AKT过表达载体再转染AKTRi细胞观察RESCUE效果。(1)Western blot检测24 h后P62和MAPLC3的表达:与相同处理的空载体p SUPER组比较,AKTRi组P62的表达明显降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高。与假照组比较,8 Gy照射组P62的表达在空载体p SUPER细胞模型中降低51.49%,在AKTRi细胞模型降低59.36%;与假照组比较,8 Gy照射组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值在空载体p SUPER细胞模型中升高29.79%,在AKTRi细胞模型中升高58.98%。过表达AKT后,与相同处理的空载体Vector组比较,过表达AKT组P62的表达明显升高,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低。与假照组比较,8 Gy照射组P62的表达在空载体Vector细胞模型中降低21.21%,在AKT过表达细胞模型中降低8.35%;与假照组比较,8 Gy照射组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值在空载体Vector细胞模型中升高45.60%,在AKT细胞模型中升高5.88%。(2)MTT检测72 h后细胞存活率:与假照组比较,8 Gy照射组细胞存活率在空载体p SUPER细胞模型中降低23.65%,在AKTRi细胞模型中降低46.21%。过表达AKT后,与假照组比较,8 Gy照射组细胞存活率在空载体Vector细胞模型中降低30.21%,在AKT过表达细胞模型中降低13.73%(P<0.05)。以上结果表明,沉默AKT明显促进电离辐射诱导的He La细胞自噬性死亡,而过表达AKT则明显抑制电离辐射诱导的He La细胞自噬性死亡。结论1.电离辐射诱导Hela细胞自噬性死亡并降低HSP90α的表达。2.d CK可能是HSP90α的底物蛋白,d CK的稳定表达及功能活性需要HSP90α维持。3.HSP90α/d CK通过维持AKT的表达调节电离辐射诱导的Hela细胞自噬性死亡。