慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD),是一种十分常见的呼吸系统疾病,严重影响患病者的个人健康和日常生活质量。香烟烟雾、环境空气污染暴露,反复气道感染这些都是慢阻肺的致病因素。其中,香烟烟雾是慢性阻塞性肺疾病发病机制中的最主要危险因素之一。慢阻肺是一种临床概念,包含复杂的病理特征和改变。通常认为,小气道阻塞是慢阻肺最主要的病理特征,长期存在的气道炎症影响疾病的发展。另一方面,终末段肺泡壁的破坏造成的肺气肿也是慢阻肺的病理变化之一。在本次研究中,我们主要研究肺泡壁结构中肺上皮细胞在香烟烟雾刺激下的病理变化。一般认为,香烟烟雾可以在肺泡上皮细胞中诱导其线粒体损伤,诱导肺上皮细胞凋亡,从而导致COPD。然而,对于线粒体损伤的确切分子机制仍然未知。线粒体膜通透性与细胞自身的状态有着十分密切的联系,线粒体是真核细胞中独有的细胞器,在能量产生,信息交流,物质合成过程中发挥着极其重要的作用。线粒体由磷脂双分子层结构的外膜,内膜,以及内外膜间隙和线粒体基质构成。线粒体膜的通透性主要由膜上的蛋白通道发挥作用,其中常见的孔通道蛋白包括位于线粒体内膜的腺苷酸转运体(adenine nucleotide translocase,ANT)、金属蛋白酶、磷酸盐载体(phos-phatic carrier,Pi C)、c环内解耦连通道F1FO-ATP合成酶,及位于外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion-selectivechannel,VDAC)和线粒体基质的clophilin D,Cyp D)等,这些共同影响了线粒体的膜通透性,ANT发挥主要作用,其调控线粒体膜电位变化和细胞凋亡。ANT占线粒体总蛋白的10%,有同家族蛋白ANT1~4。最初发现ANT的生理功能主要是催化线粒体内膜上的ADP/ATP交换。在正常生理呼吸条件下,线粒体中ATP 4-氧化磷酸化产生的蛋白质被输出到细胞质中用于细胞活动,而ADP 3-被输入到线粒体基质中以连续进行ATP合成。因此,ANT是ADP 3-/ATP 4-交换器。在这种严格的交换过程中,一个净负电荷从基质移至细胞质,从而导致电荷差异,该差异由跨过线粒体内膜的膜电位驱动。ANT以相对较低的亲和力与其底物结合,而ANT的高丰度可以补偿效率低下的运输。ANT还具有介导质子泄漏的内在特性。线粒体膜间隙与线粒体基质间的质子浓度差被称作线粒体膜电位,其作为驱动ATP合成的主要动力,是线粒体正常生理功能行驶的重要组成。ANT介导质子泄露的特性与线粒体膜电位紧密相关。ANT通道的开放有可能造成线粒体膜电位的下降。肺上皮细胞凋亡是造成慢阻肺的发病分子机制之一,一般认为香烟烟雾激活了肺上皮细胞凋亡相关蛋白家族,启动细胞凋亡程序。但是慢阻肺发病过程中,线粒体膜通透性的机制尚无研究。为了研究香烟烟雾对肺上皮细胞线粒体膜通透性的影响,我们使用10%香烟烟雾提取物(Cigarette smoke extract,CSE)处理肺上皮细胞A549模拟肺部受香烟烟雾刺激,研究ANT在此过程的作用机制。第一部分CSE对肺上皮细胞的毒性作用1.制备CSE来刺激肺上皮细胞A549,使用不同浓度的CSE(1%,5%,10%,30%,50%)和不同时间(0.5h,1h,2h,4h,8h),检测肺上皮细胞线粒体自噬情况,线粒体自噬作为线粒体健康的指标之一,与线粒体融合分裂以及ATP产生有关。使用Western Blot检测线粒体自噬相关指标Parkin蛋白的表达。结果显示,CSE会诱导肺上皮细胞线粒体分裂增加,融合减少,线粒体碎片化。并且,CSE会浓度和时间依赖性诱导肺上皮细胞的线粒体自噬。2.线粒体ATP合成下降会通过AMPK信号通路机会诱导线粒体自噬。上一步的实验我们发现CSE诱导肺上皮细胞线粒体自噬。为了进一步确定CSE诱导线粒体自噬的原因,我们研究了CSE刺激下的肺上皮细胞ATP的合成。使用含有荧光素酶的ATP试剂盒,检测10%CSE刺激A549细胞6h后,细胞总ATP的含量。结果显示,与实验组相比,10%CSE组ATP合成明显下降。3.使用线粒体活性氧荧光探针标记肺上皮细胞线粒体活性氧,检测10%CSE刺激6h后肺上皮细胞A549活性氧的改变。结果显示,10%CSE可以显著增加肺上皮细胞线粒体活性氧的产生。4.使用Seahorse XF24细胞能量代谢仪检测10%CSE对肺上皮细胞能量代谢模式的影响。在10%CSE处理6h后,进行糖酵解和线粒体应激能量反应检测。结果显示,在受到CSE的刺激后,细胞的能量代谢模式由线粒体呼吸模式向糖酵解模式偏移;但是糖酵解和线粒体氧化磷酸化能力都受到明显抑制。5.正常的膜电位有利于细胞功能正常功能的行驶。线粒体膜电位与线粒体膜通透性具有直接关系,膜电位下降被认为是细胞凋亡的先行现象。使用JC-1荧光探针对线粒体膜电位进行标记,检测10%CSE刺激6h后肺上皮细胞膜电位的改变。结果显示,10%CSE可以显著降低肺上皮细胞线粒体膜电位。6.使用Annexin V/PI染料标记10%CSE刺激6h后的肺上皮细胞,使用流式细胞仪分析肺上皮细胞凋亡状况。结果显示,CSE能够明显的增加肺上皮细胞的凋亡比例。第二部分CSE增加线粒体膜通透性的机制研究在第一部分中,发现线粒体膜电位下降是慢性阻塞性肺疾病肺上皮细胞线粒体受损的核心事件,为了明确CSE改变膜电位的机制,在这部分内容中,我们主要研究了构成线粒体膜电位的线粒体呼吸链及ANT蛋白。1.为了明确线粒体呼吸链的结构完整性,利用Western Blot方法检测10%CSE刺激后肺上皮细胞线粒体呼吸链复合物的表达。结果显示,A549线粒体复合物Ⅲ表达明显下降。3.蛋白的功能与自身的表达和修饰有关,上一节明确了呼吸链的表达,但是呼吸链的功能尚不明确。为了明确CSE对肺上皮细胞线粒体呼吸链的影响,我们使用Seahorse XF24细胞能量代谢仪检测CSE对肺上皮细胞线粒体复合物功能的影响。结果显示,CSE抑制肺上皮细胞线粒体复合物Ⅲ和Ⅴ的活性。4.ANT蛋白在调节线粒体膜通透性中发挥着重要作用,为了研究ANT蛋白在CSE刺激下,影响肺上皮细胞线粒体膜通透性的机制。使用ANT特异性的激动剂Carboxyatractyloside和抑制剂ADP。结果显示,CSE和ANT激动剂由协同作用,而和ANT抑制剂有相反的作用。5.使用ANT特异性抑制剂Bongkrekic acid,再用10%CSE刺激肺上皮细胞6h,使用流式细胞仪检测CSE刺激后肺上皮细胞凋亡状况。结果显示,50μM ADP之后,CSE+ADP组的凋亡相对于CSE组下降,表明,抑制ANT可以抑制CSE造成的肺上皮细胞凋亡。结论:综上所述,本研究发现CSE可以损伤肺上皮细胞线粒体,且诱导线粒体膜电位下降,ROS增加,ATP合成减少,并造成其代谢模式发生改变。线粒体产生ATP不足的情况下,肺上皮细胞线粒体发生自噬以清除碎片化的线粒体。CSE通过降低线粒体复合物Ⅲ的表达和活性,以及激活ANT质子转运功能,增加了线粒体膜通透性,导致了肺上皮细胞线粒体自噬,诱导凋亡。本研究发现CSE可以诱导ANT质子通道功能开放,造成肺上皮细胞线粒体损伤,这为研究慢阻肺发病机制提供了新的基础研究思路。