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目的:研究刺头复叶耳蕨总黄酮(total flavonoids from arachniodes exilis,TFAE)在人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)成骨分化中的作用,并进一步研究雌激素受体(estrogen receptor,ER)信号途径在其中的作用。方法:(1)采用组织块贴壁法分离、培养hUCMSCs,倒置相差显微镜观察细胞形态及生长。以下所有实验均采用第3代对数生长期hUCMSCs进行。(2)TFAE对hUCMSCs活性的影响:实验分为5组:0μg/mLTFAE组(对照组),1μg/mLTFAE组,5μg/mLTFAE组,10μg/mLTFAE组,20μg/m LTFAE组,分别作用24h、48h、72h后,CCK-8法检测细胞活性。(3)TFAE对hUCMSCs成骨分化的影响:根据细胞活性检测结果,实验分为4组:对照组(常规培养基),0μg/mLTFAE组(0μg/mLTFAE的成骨诱导培养基),1μg/mLTFAE组(1μg/mLTFAE的成骨诱导培养基),5μg/mLTFAE组(5μg/m LTFAE的成骨诱导培养基),诱导培养3d、7d后,AMP法测定ALP活力;诱导培养14d后,茜素红染色检测钙结节,RT-PCR检测成骨相关基因Ⅰ型胶原a1(collagen type I alpha1,Col1a1)、骨桥蛋白(osteopotin,OPN)、Runx2、Osterix(Osx)mRNA表达水平。(4)ER在hUCMSCs成骨分化中的作用:实验分为4组:对照组(0μg/m LTFAE的成骨诱导培养基),TFAE组(5μg/mLTFAE的成骨诱导培养基),TFAE+S组(5μg/mLTFAE的成骨诱导培养基+S1191),S组(S1191),诱导培养3d、7d后,AMP法测定ALP活力;诱导培养14d后,茜素红染色检测钙结节,RT-PCR检测成骨相关基因Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表达水平。结果:(1)脐带组织贴壁培养3-5d后,培养皿中有细胞长出,培养10-14d,组织块周围长满成纤维样细胞,经传代培养后,细胞形态均一,贴壁良好。(2)细胞活性检测结果:CCK-8检测结果显示,与对照组相比,1μg/mLTFAE组、5μg/mLTFAE组细胞活性明显增强(P<0.05或P<0.01),10μg/mLTFAE组、20μg/mLTFAE组细胞活性明显减弱(P<0.05或P<0.01)。(3)hUCMSCs成骨分化检测结果:1)ALP检测结果显示:与对照组相比,0μg/mLTFAE、1μg/m LTFAE组及5μg/m LTFAE组细胞ALP活力明显增强(P<0.05或P<0.01),与0μg/mLTFAE组,1μg/mLTFAE组及5μg/m LTFAE组细胞ALP活力也明显增强(P<0.05或P<0.01);2)茜素红染色结果显示:不同浓度TFAE组均有钙结节形成,而对照组未见钙结节,与0μg/mLTFAE组相比,1μg/mLTFAE组及5μg/mLTFAE组钙结节数量明显增多(P<0.01);3)RT-PCR检测结果显示:与对照组相比,0μg/mLTFAE组、1μg/mLTFAE组及5μg/m LTFAE组成骨相关基因Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表达量明显增加(P<0.01),与0μg/mLTFAE组相比,1μg/mLLTFAE组及5μg/mLTFAE组Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表达量也明显增加(P<0.05或P<0.01)。(4)ER抑制剂作用下,hUCMSCs成骨分化检测结果:1)ALP检测结果显示:与对照组相比,TFAE组细胞ALP活力明显增强(P<0.01),与TFAE组相比,TFAE+S组细胞ALP活力明显减弱(P<0.05或P<0.01),对照组与S组无差异;2)茜素红染色结果显示:各组均有钙结节形成,与对照组相比,TFAE组钙结节数量增多(P<0.01),而与TFAE组相比,TFAE+S组钙结节数量明显减少(P<0.01),对照组与S组无差异;3)RT-PCR检测结果显示:与对照组相比,TFAE组成骨相关基因Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表达量明显增加(P<0.01),与TFAE组相比,TFAE+S组Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表达量明显减少(P<0.05或P<0.01),对照组与S组无差异。结论:(1)一定浓度的TFAE增强hUCMSCs活性及促进其成骨分化。(2)TFAE通过ER信号途径促进hUCMSCs成骨分化。