糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病最常见的并发症,DPN患者的疼痛是临床上最常见的神经病理性疼痛之一,即使联合应用多种镇痛药物也难以缓解。除控制血糖外(但往往是难以控制的),目前尚没有相应的有效治疗措施以解除病人的痛苦,给患者的生活质量带来严重的负面影响,而且DPN还是引起糖尿病患者死亡的重要原因。这种神经病理性疼痛发病机制目前尚不清楚。可见,探讨DPN患者疼痛的精确的分子机制,对于缓解DPN患者的疼痛、阻止或延缓DPN的发病进程、甚至延长DPN患者的寿命都具有至关重要的意义。因此,本课题将利用链脲霉素(streptozotocin, STZ)诱发的DPN神经病理性疼痛大鼠动物模型以及体外培养的背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)神经元,研究钾通道KCNQ2/3/5在DPN神经病理性疼痛发病过程中的作用及其机制,并进一步探讨与DPN发病有关的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end-products, AGEs)与钾通道KCNQ2/3/5的相互作用关系。本课题的研究结果不但为解释DPN神经病理性疼痛的发病机制增添新的内容,而且还可能为DPN神经病理性疼痛的治疗提供新的靶点。第一部分钾通道KCNQ2/3/5在糖尿病神经病变大鼠背根神经节神经元的表达及其功能研究在DRG神经元表达的KCNQ2/3/5钾离子通道是最近发现的在神经病理性疼痛发病机制中占有重要地位的离子通道,但其在DPN神经病理性疼痛发病中的作用及其机制目前尚不清楚。因此,本课题利用STZ诱发的DPN神经病理性疼痛大鼠模型,研究KCNQ2/3/5钾离子通道在DRG神经元的表达变化,并利用全细胞膜片钳记录技术分析DPN大鼠DRG神经元M电流密度以及神经元的兴奋性变化,并进一步研究特异性KCNQ钾离子通道开放药——瑞替加滨(Retigabine)和特异性KCNQ钾离子通道阻断XE991对DRG神经元M电流密度、神经元兴奋性及DPN大鼠触觉异常性疼痛和热痛觉过敏的影响作用。结果显示,DPN神经病理性疼痛大鼠DRG神经元KCNQ2、KCNQ3和KCNQ5的表达水平下调,并伴有M电流密度的降低和神经元兴奋性的升高；Retigabine可激活DPN神经病理性疼痛大鼠DRG神经元的KCNQ钾离子通道,使M电流密度增大和神经元的兴奋性降低,缓解DPN大鼠的触觉异常性疼痛和热痛觉过敏症状；XE991可抑制DPN神经病理性疼痛大鼠DRG神经元的KCNQ钾离子通道,使M电流密度减小和神经元的兴奋性升高,加重DPN大鼠的触觉异常性疼痛和热痛觉过敏症状。以上结果表明,KCNQ2/3/5通道的表达和活性在DPN神经病理性疼痛的发病机制中扮演着重要的角色,因此修正KCNQ2/3/5通道的表达和调节其活性是缓解DPN神经病理性疼痛的一种有效治疗手段。即使KCNQ表达有所降低,具有一定活性的KCNQ通道开放也能够产生足够的M电流使神经元维持正常的兴奋状态,这表明即使DRG神经元受到一定程度的伤害,对KCNQ通道的调控也具有缓解神经病理性疼痛的作用,这一点很可能会是具有广泛应用前景的。第二部分糖基化终末产物对大鼠背根神经节神经元钾通道KCNQ2/3/5的影响作用晚期糖基化终末产物(advanced glycation end-products, AGEs)的过度积聚是最近新发现的一个与DPN发病有关的生物化学信号通路。进一步的研究发现,AGEs及其受体(receptor for AGEs, AGER)信号系统是DPN的重要发病机制。本课题将利用体外培养的DRG神经元检测AGEs及其受体信号系统对DRG神经元KCNQ通道和神经元兴奋性的影响作用及其机制。结果显示,AGEs能够减少KCNQ2、KCNQ3和KCNQ5阳性神经元的比例,并降低KCNQ2/3/5通道的免疫荧光强度；AGEs可使培养的DRG神经元AGER、mRNA及蛋白水平升高,而KCNQ2、KCNQ3和KCNQ5通道的mRNA及蛋白水平则降低；AGEs可显著降低DRG神经元的M电流密度,并提高神经元的兴奋性；AGEs 对 KCNQ通道表达和活性影响的效应可被AGER siRNA部分阻断。以上结果表明,AGEs及其受体信号系统可通过对KCNQ2/3/5的调控影响DRG神经元的兴奋性,AGEs-AGER结合所产生的持续的激活、受体上调、进一步激活的循环状态,可能是DPN发病或加重DPN程度的一个重要机制。第三部分糖基化终末产物受体小RNA干扰对糖尿病大鼠背根神经节神经元钾通道KCNQ2/3/5的影响作用AGEs及其受体信号系统在DPN的发生和发展过程中发挥关键作用,减少AGEs生成或促进其清除的药物以及AGER拮抗剂都是缓解DPN的潜在治疗措施或治疗药物。因此,针对AGER的siRNA是否具有改善DPN症状的作用,是需要进行探讨的一个新的潜在性治疗措施。本课题利用STZ诱发的DPN大鼠研究了AGER siRNA对DPN神经病理性疼痛的影响作用及其机制。结果显示,鞘内注射AGER siRNA对DPN大鼠的触觉异常性疼痛和热痛觉过敏症状具有一定的改善作用；DPN神经病理性疼痛大鼠DRG组织AGER mRNA及蛋白表达上调,鞘内注射AGER siRNA使DPN神经病理性疼痛大鼠DRG组织AGER mRNA及蛋白表达下调；DPN神经病理性疼痛大鼠DRG组织KCNQ2/3/5 mRNA及蛋白表达下调,鞘内注射AGER siRNA使DPN神经病理性疼痛大鼠KCNQ2/3/5mRNA及蛋白表达上调；DPN神经病理性疼痛大鼠DRG神经元M电流密度降低,神经元兴奋性升高,鞘内注射AGER siRNA使DPN神经病理性疼痛大鼠DRG神经元M电流密度升高,神经元兴奋性下降。以上结果表明,通过AGERsiRNA下调AGEs及其受体信号系统可显著缓解DPN大鼠的神经病理性疼痛,其缓解神经病理性疼痛机制可能是AGER siRNA使DPN大鼠DRG神经元已经上调的AGER表达下调,并使DPN大鼠DRG神经元已经下调的KCNQ2/3/5表达上调,从而使DPN大鼠DRG神经元M电流密度降低、神经元兴奋性升高,这是缓解DPN神经病理性疼痛的一个重要机制。AGEs及其受体AGER siRNA信号系统和/5通道可能是DPN神经病理性疼痛的潜在治疗靶点。KCNQ2/3