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目的:阿尔茨海默病（AD）是一种中枢神经系统渐进性的退行性病变。脂蛋白脂酶（LPL）与AD的发病密切相关。定位于脑微血管内皮细胞的LPL被证明主要来源于外周组织,我们的前期研究发现AD模型小鼠脑微血管内皮细胞LPL表达降低,其可能原因是由脂肪组织LPL表达降低所致;限时摄食可抑制AD模型小鼠脑微血管内皮细胞LPL表达的下降。然而,限时摄食是否通过调节脂肪组织LPL表达进而拮抗AD模型小鼠脑微血管内皮细胞LPL表达的降低,有待证实。LPL的上游转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是否参与限时摄食对AD脂肪组织LPL表达的调控,亦未见报道。限时摄食能够升高血中β-羟基丁酸（βOHB）水平,且βOHB可通过抑制组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）、HDAC3稳态调控AD神经细胞LPL表达。HDACs与LPL的表达及调控作用均具有组织特异性,HDAC2/3是否参与限时摄食经βOHB调控AD脂肪细胞LPL表达,以及PPARγ是否参与上述作用,尚待研究。脑内β-淀粉样蛋白（Aβ）聚积是导致AD发病的重要环节,主要是由于脑内Aβ清除障碍所致。脑内Aβ清除的主要途径是跨血脑屏障（BBB）转运出脑,脑微血管内皮细胞是BBB的重要组成部分。我们前期研究显示限时摄食可减少AD模型小鼠脑内Aβ沉积;而定位于脑微血管内皮细胞LPL是否通过调节脑内Aβ跨BBB转运,参与限时摄食减少AD脑内Aβ沉积,未见报道。位于脑微血管内皮细胞基底膜侧的低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）在脑内Aβ跨BBB转运中具有重要作用,LPL能够促进细胞摄取低密度脂蛋白（LDL）使胞内胆固醇水平升高。有证据表明,LDL可调控血管平滑肌细胞LRP1表达,胆固醇又可通过调控人胚胎肾细胞细胞解聚素样金属蛋白酶10（ADAM10）、ADAM17的表达而影响LRP1的功能。然而,脑微血管内皮细胞LPL是否经LRP1促进脑内Aβ从细胞基底膜侧进入胞内,以及LPL是否影响胞内运载Aβ的初级内体（Rab5）、分拣内体（Rab11）和细胞腔膜上Aβ流出泵ATP结合盒转运体B1（ABCB1）,从而参与限时摄食减少AD模型小鼠脑内Aβ沉积,尚有待探讨。综上,本研究结合体内、体外实验探讨了限时摄食是否调控AD脂肪组织LPL表达从而促进脑内Aβ经血脑屏障转运的作用及可能机制。研究方法:1、实验动物分组、处理及样品采集:将5月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠及同窝出生的野生型小鼠分为AD模型组和野生对照组（自由摄食）、AD禁食组和野生禁食组（摄食与禁食各24 h交替进行）,连续处理5个月,取血后处死,取小鼠腹部脂肪组织及脑组织。2、细胞培养、处理及样品采集:2.1首先将体外培养的小鼠前体脂肪（3T3-L1）细胞分为对照组、βOHB组、Aβ（0.5、2μM）处理组及βOHB+Aβ（0.5、2μM）干预组,单纯βOHB组及βOHB+Aβ（0.5、2μM）干预组加入1 mMβOHB预处理3 h,再向Aβ（0.5、2μM）处理组及βOHB+Aβ（0.5、2μM）干预组加入0.5或2μM Aβ继续培养细胞12 h,收集全部细胞。其次siRNA干扰实验分siRNA-HDAC2或siRNA-HDAC3组与Scrambled siRNA组,向siRNA-HDAC2或siRNA-HDAC3组细胞中分别加入含50 nM HDAC2或HDAC3siRNA的1%胎牛血清无双抗的细胞培养基,向Scrambled siRNA组细胞中加入含50 nM阴性对照si RNA的1%胎牛血清无双抗的细胞培养基,细胞继续培养24 h,收集全部细胞。2.2首先将体外培养的人脑微血管内皮细胞（HBMEC）,分为对照组与MβCD处理组（用于降低脑微血管内皮细胞游离胆固醇水平）,向MβCD组各孔中加入含5 mM MβCD的内皮细胞培养基,向对照组各孔中只加入内皮细胞培养基,培养30 min收集全部细胞。其次将HBMEC细胞分为对照组、单纯LPL组、单纯LDL组及LPL+LDL组,单纯LPL组及LPL+LDL组加入1μg/mLLPL预处理3 h,向单纯LDL组及LPL+LDL组加入62.5μg/mLLDL继续培养24 h收集全部细胞。最后将体外BBB模型小室上仓中的HBMEC细胞分为对照组、单纯LPL组、单纯LDL组及LPL+LDL组,上仓细胞经LPL或LDL处理后（操作方法同前）,向下仓加1 nM Aβ1-40继续干预1 h,收集全部细胞及培养基。3、检测指标及方法:3.1采用RT-PCR法及Western Blotting法检测脂肪组织LPL、PPARγ、HDAC2/3mRNA及蛋白表达水平和Ace-H3K9/H4K12水平。3.2采用油红“O”染色法检测脂滴水平及采用RT-PCR法及Western Blotting法检测PPARγ表达水平以判断3T3-L1细胞分化情况;采用RT-PCR法及Western Blotting法检测3T3-L1细胞LPL、PPARγ、HDAC2/3 mRNA及蛋白表达水平和Ace-H3K9/H4K12水平。3.3采用RT-PCR法及Western Blotting法检测细胞HDAC2/3 mRNA及蛋白表达水平（判断沉默效果）,以及LPL、PPARγmRNA及蛋白表达水平。3.4采用免疫荧光双标法分别检测小鼠脑微血管内皮细胞Aβ、LRP1、ADAM10、ADAM17、Rab5、Rab11及ABCB1表达水平（CD31作为脑微血管内皮细胞标志物）;采用ELISA法检测血Aβ水平。3.5采用ELISA法检测HBMEC细胞游离胆固醇水平;采用RT-PCR法及Western Blotting法检测细胞LRP1、ADAM10、ADAM17、Rab5、Rab11及ABCB1 mRNA及蛋白表达水平;采用ELISA法检测培养基中sLRP1水平。3.6采用免疫荧光法检测体外BBB模型细胞间紧密连接蛋白ZO-1的表达;采用ELISA法检测HBMEC细胞及培养基中Aβ水平。4、采用SPSS12.0对数据进行统计分析,P<0.05时认为差异具有统计学意义。结果:1、限时摄食可抑制APPswe/PS1dE9双转基因AD模型小鼠脂肪组织LPL、PPARγ表达水平、Ace-H3K9/H4K12水平的降低以及HDAC2/3表达水平的升高:AD模型组与野生对照组相比,小鼠脂肪组织LPL、PPARγ表达水平及Ace-H3K9/H4K12水平降低,HDAC2/3表达水平升高（P<0.01）;AD禁食组与AD模型组相比,LPL、PPARγ表达水及Ace-H3K9/H4K12水平升高,HDAC2/3表达水平降低（P<0.01）。2、βOHB可抑制0.5或2μMAβ处理的3T3-L1细胞LPL、PPARγ表达水平的升高或降低,Ace-H3K9/H4K12水平的降低以及HDAC2/3表达水平的升高:3T3-L1分化后细胞显示大量深红色脂滴,PPARγ表达水平升高（P<0.01）。与对照组相比,βOHB组和Aβ（0.5μM）组细胞LPL、PPARγ表达水平及Ace-H3K9/H4K12水平升高,HDAC2/3表达水平降低;Aβ（2μM）组细胞LPL、PPARγ表达水平及Ace-H3K9/H4K12水平降低,HDAC2/3表达水平升高（P<0.01）。与Aβ（0.5μM）组相比,Aβ（2μM）组和βOHB+Aβ（0.5μM）组细胞LPL、PPARγ表达水平及Ace-H3K9/H4K12水平降低,HDAC2/3表达水平升高（P<0.01）。与Aβ（2μM）组相比,βOHB+Aβ（2μM）组细胞LPL、PPARγ表达水平及Ace-H3K9/H4K12水平升高,HDAC2/3表达水平降低（P<0.01）。3、沉默细胞HDAC2或HDAC3可降低或升高LPL及PPARγ表达:与Scrambled siRNA组相比,siRNA-HDAC2组细胞LPL和PPARγmRNA及蛋白表达水平均降低;与Scrambled siRNA组相比,siRNA-HDAC3组细胞LPL和PPARγmRNA及蛋白表达水平均升高。4、限时摄食可抑制AD模型小鼠脑微血管内皮细胞Aβ水平的升高、LRP1表达的降低及ADAM10/17表达水平的升高:与野生对照组相比,AD模型组及AD禁食组小鼠脑微血管内皮细胞Aβ表达水平升高（P<0.01）;AD禁食组小鼠与AD模型组相比,脑微血管内皮细胞Aβ表达水平降低（P<0.05）。AD禁食组与AD模型组相比,小鼠血中Aβ水平差异无统计学意义（P>0.05）。与野生对照组相比,AD模型组小鼠脑微血管内皮细胞LRP1表达水平降低（P<0.01）;AD禁食组与AD模型组相比,小鼠脑微血管内皮细胞LRP1表达水平升高（P<0.01）。与野生对照组相比,AD模型组小鼠脑微血管内皮细胞ADAM10/17蛋白表达水平升高（P<0.01）;AD禁食组与AD模型组相比,小鼠脑微血管内皮细胞ADAM10/17蛋白表达水平降低（P<0.01）。各组小鼠脑微血管内皮细胞Rab5、Rab11蛋白表达水平之间差异均无统计学意义（P>0.05）。与野生对照组相比,AD模型组及AD禁食组小鼠脑微血管内皮细胞ABCB1蛋白表达降低（P<0.01）;AD禁食组与AD模型组相比,小鼠脑微血管内皮细胞ABCB1蛋白表达水平之间差异无统计学意义（P>0.05）。5、HBMEC细胞游离胆固醇水平降低可下调LRP1表达、上调ADAM10/17表达水平:与对照组相比,MβCD处理组细胞内游离胆固醇水平下降,LRP1表达水平均降低,培养基sLRP1水平降低,ADAM10和ADAM17表达水平升高（P<0.01）;与对照组相比,MβCD处理组细胞Rab5、Rab11和ABCB1 mRNA及蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。对照组与LPL组细胞内游离胆固醇、LRP1表达、培养基sLRP1及ADAM10/17表达水平之间的差异均无统计学意义（P>0.05）。6、LPL可通过LDL升高HBMEC游离胆固醇水平,进而上调LRP1、下调ADAM10/17表达水平:LDL及LPL+LDL组细胞内游离胆固醇、LRP1表达及培养基sLRP1水平均高于对照组,ADAM10/17表达水平均低于对照组（P<0.01）;与LPL组相比,LDL及LPL+LDL组细胞内游离胆固醇、LRP1表达及培养基sLRP1水平均升高,ADAM1/17表达水平降低（P<0.01）;与LDL组相比,LPL+LDL组细胞内游离胆固醇、LRP1水平均升高（P<0.01）、培养基中sLRP1水平无统计学差异（P>0.05）,ADAM10/17表达水平降低（P<0.01）。各组细胞Rab5、Rab11和ABCB1的表达水平之间差异均无统计学意义（P>0.05）。7、LPL可通过LDL促进Aβ进入HBMEC细胞,但不影响Aβ转出细胞:体外BBB模型相邻细胞间出现紧密连接蛋白ZO-1的连续表达。小室下仓,LPL组Aβ水平与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）,LDL及LPL+LDL组Aβ水平低于对照组（P<0.01）;与LPL组相比,LDL及LPL+LDL组Aβ水平降低（P<0.01）;与LDL组相比,LPL+LDL组Aβ水平降低（P<0.01）。HBMEC细胞内,LPL组Aβ水平与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）,LDL及LPL+LDL组Aβ水平升高（P<0.01）;与LPL组相比,LDL及LPL+LDL组Aβ水平升高（P<0.01）;与LDL组相比,LPL+LDL组Aβ水平升高（P<0.01）。小室上仓,各组Aβ水平均无统计学差异（P>0.05）。结论:限时摄食可调控AD模型小鼠脂肪组织LPL的表达,作用机制可能是βOHB经HDAC2、HDAC3介导参与了限时摄食对脂肪组织LPL表达的调控,且PPARγ参与上述调节过程;LPL可通过调节脑微血管内皮细胞LRP1表达,进而促进脑内Aβ经BBB转运,从而介导了限时摄食的抗AD作用。