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本研究通过肉仔鸡饲养试验和淋巴细胞体外培养试验,系统地探讨了黑沙蒿水提物(AOE)对脂多糖(LPS)刺激的肉仔鸡免疫应激的缓解作用及其作用机理。试验1~3研究了AOE对LPS刺激的肉仔鸡生长性能、免疫功能和抗氧化功能的影响及其分子机制。通过注射LPS构建肉仔鸡的免疫应激模型,采用2×2二因子试验设计,即两个日粮处理组(添加0或1000 mg/kg AOE)和两个LPS处理组(注射LPS或等量的生理盐水)。选取96只1日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡随机分为4个处理,每个处理6个重复,每个重复4只鸡。处理1和处理2饲喂基础日粮,处理3和处理4在基础日粮的基础上添加1000 mg/kg AOE。试验第14、16、18、20天时,处理1和处理3肉仔鸡按每kg体重500μg LPS的剂量腹腔注射LPS溶液,处理2和处理4肉仔鸡注射等量生理盐水。试验期为21天,分为未注射LPS期(非应激期,1-14天)和注射LPS期(应激期,14-21天)。结果显示:(1)饲喂AOE对非应激期肉仔鸡生长性能没有显著影响(P>0.05),但却缓解了应激期肉仔鸡因注射LPS导致的ADG和ADFI的降低(P<0.05);AOE缓解了应激期肉仔鸡因注射LPS引起的血清皮质酮(CORT)含量的升高(P=0.054)。提示AOE能缓解由LPS引起的肉仔鸡采食量和生长速度的下降,同时缓解了免疫应激肉仔鸡血清CORT浓度的升高。(2)AOE显著抑制了由于LPS刺激引起的脾脏指数的升高(P<0.05),缓解了免疫应激状态下肉仔鸡血清中IL-2、IgA、sCD8含量的升高(P<0.05),同时降低了肉仔鸡血清中TNF-α(P=0.081)和IgG(P=0.079)的含量;AOE显著缓解了LPS引起的肉仔鸡血清MDA含量的升高(P<0.05),且使血清中CAT含量呈升高趋势(P=0.097)。提示AOE缓解了肉仔鸡免疫系统因注射LPS而过度激活,发挥了抗炎免疫作用;另一方面通过提高肉仔鸡抗氧化功能来抵抗LPS造成的免疫应激。(3)日粮中AOE显著降低了免疫应激肉仔鸡肝脏中MyD88、IL-1β的基因表达量(P<0.05),而提高了SOD、GSH-Px的基因表达量(P<0.05);显著降低了脾脏中iNOS的基因表达量(P<0.05);显著降低了十二指肠中TLR4、TNF-α、iNOS的基因表达量(P<0.05),提高了CAT的基因表达量(P<0.05);显著降低了空肠中TLR4、MyD88、IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS的基因表达量(P<0.05),提高了CAT的基因表达量(P<0.05);显著降低了回肠中NF-κB、IL-1β和iNOS的基因表达量(P<0.05),提高了GSH-Px的基因表达量(P<0.05)。提示AOE缓解免疫应激肉仔鸡的生长抑制是通过降低LPS刺激的肉仔鸡组织中TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的基因表达量及提高CAT、SOD和GSH-Px的基因表达量来实现的。试验4通过体外法研究了黑沙蒿多糖(AOP)对LPS刺激的外周血淋巴细胞(PBL)免疫和抗氧化功能的影响及其分子机制。首先,采用2×5二因子试验设计,即2个LPS水平(不添加LPS;添加LPS)和5个AOP水平(0、25、50、100、200μg/m L),共设10个处理,每个处理6个重复,研究不同剂量AOP对PBL免疫、抗氧化指标的影响及其分子机制,并筛选适宜添加量;其次,采用2×2×2三因子试验设计,即2个LPS刺激水平(不添加LPS;添加LPS)、2个AOP添加水平(不添加AOP;添加AOP,添加剂量依据前述体外试验确定)、2个NF-κB抑制剂(PDTC)添加水平(不添加PDTC;添加PDTC),试验共设8个处理,每个处理6个重复。研究在PDTC存在下,AOP对PBL免疫和抗氧化指标的影响及其分子机制。结果显示:(1)在正常培养条件下,AOP显著提高了PBL培养液中TNF-α、SOD的含量和T-AOC(P<0.05);在LPS刺激状态下,AOP显著降低了PBL培养液中IL-6、NO的含量和iNOS的活性(P<0.05),提高了SOD的活性(P<0.05);从分子指标看,AOP显著抑制了LPS对TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS基因表达的影响(P<0.05),提高了PBL中GSH-Px和SOD的基因表达(P<0.05)。这提示,在正常培养条件下,AOP发挥免疫、抗氧化功能并不是通过TLR4/NF-κB途径来实现的;而在LPS刺激下,AOP可以通过降低TLR4和NF-κB的基因表达,下调下游炎性细胞因子基因的过度表达,抑制PBL的炎症反应,另一方面可以提高GSH-Px和SOD的基因表达来减轻PBL的脂质过氧化损伤。(2)在正常培养条件下,AOP显著提高了PBL培养液中TNF-α、IL-6的含量和T-AOC(P<0.05)。在LPS刺激状态下,PDTC显著降低了PBL培养液中IL-1β、IL-6、TNF-α、NO和MDA的含量,提高了SOD的活力(P<0.05),降低了PBL中NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的基因表达量(P<0.05);AOP显著的降低了PBL培养液中IL-1β、IL-6、TNF-α、NO和MDA的含量和iNOS的活性(P<0.05),降低了PBL中TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6和iNOS的基因表达量(P<0.05);在AOP和PDTC同时存在时,AOP显著提高了SOD的基因表达(P<0.05),但对培养液中免疫和抗氧化指标均无显著影响。这提示AOP的抗炎免疫作用是通过TLR4/NF-κB途径来实现的,且AOP发挥的抗氧化作用也可能是其抗炎作用的另一种途径。试验5研究了黑沙蒿去多糖水提物(RAOP)对LPS刺激的外周血淋巴细胞(PBL)免疫和抗氧化功能的影响及其分子机制。其试验设计及细胞培养方法与试验4相同。结果显示:(1)在正常培养条件下,RAOP对PBL培养液中免疫指标无显著影响,但却显著提高了SOD的活性和T-AOC(P<0.05),降低了MDA的含量(P<0.05),提高了PBL中GSH-Px的表达量(P<0.05);在LPS刺激状态下,RAOP显著降低了PBL培养液中IL-6、TNF-α、NO的含量和iNOS的活性(P<0.05),提高了培养液中SOD的活性和T-AOC(P<0.05);降低了PBL中NF-κB、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量(P<0.05),升高了GSH-Px和CAT的基因表达量(P<0.05)。这提示,正常培养条件下,RAOP具有很强的抗氧化作用,但其免疫调节作用却并不明显。而在LPS刺激下,RAOP可以降低NF-κB的基因表达,抑制了下游炎性细胞因子基因的过度表达,另一方面可以提高PBL的抗氧化能力。(2)在正常培养条件下,RAOP显著提高了IL-1β的含量和T-AOC的活性(P<0.05)。在LPS刺激状态下,PDTC显著降低了PBL培养液中IL-1β、TNF-α、NO和IgM的含量(P<0.05),升高了SOD的活性(P<0.05),降低了PBL中NF-κB、IL-6和iNOS的基因表达(P<0.05);RAOP显著降低了IL-1β、IL-6、TNF-α、NO、IgM的含量,升高了SOD的活性和T-AOC(P<0.05),显著降低了MDA的含量(P<0.05),降低了PBL中NF-κB、TNF-α和iNOS的基因表达(P<0.05);在PDTC存在下,添加RAOP显著提高了T-AOC(P<0.05)。以上结果提示,在LPS刺激下,PDTC或RAOP单独添加时可以不同程度的抑制NF-κB的过度激活,从而抑制了下游炎性细胞因子的表达,而在PDTC存在时,添加RAOP对TLR4/NF-κB信号通路以及下游炎性细胞因子和抗氧化酶的基因表达无显著影响,但却显著提高了培养液中T-AOC的活力。这说明RAOP的抗炎免疫作用是通过发挥其抗氧化和清除自由基的能力来进一步抑制NF-κB的激活而实现的。