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研究背景微塑料是指粒径小于5mm的塑料碎片污染物,主要来源于塑料制品的分解。过去的几十年,全球的塑料生产由1950年的200万吨增长到了 2015年的3.8亿吨。预计到2050年,塑料的生产可以达到330亿吨。稳定的理化性质使得塑料广泛应用到了生活的各个方面。塑料的广泛使用增加了人类的接触机会。人类摄取微塑料的机会主要包括食物和饮水的摄取以及大气环境的吸入。目前不少的关于水产品以及食盐中也均发现了微塑料的存在。除此之外,在农副产品以及婴儿的奶粉中也发现了微塑料的踪迹。人的粪便、体液中均已检测到微塑料的存在,甚至孕妇的胎盘中也发现有微塑料的存在。不孕不育目前是一种非常普遍的疾病,全球现有7000万人受不孕不育的影响,据世卫组织估计,全球大约有9%的夫妻面临不育不孕的问题,其中50%的原因来自男性,这使得男性不育成为世界范围内亟待解决的重大科学问题,而生精异常也是导致男性不育的最常见原因。世界上将有近80%的人类疾病与环境危险因素相关,而环境污染物也是全球生殖问题的重要影响因素之一。微塑料已经被证实具有潜在生殖毒性作用,可诱导水生生物配子的氧化损伤以及胚胎发育异常等生殖毒性作用。但是关于生殖毒性在哺乳动物上的研究较少。哺乳动物与人的基因同源性较高,因此以哺乳动物小鼠为研究对象,以聚苯乙烯微塑料（Polystyrene microplastics,PS-MPS）为微塑料的代表材料,探讨微塑料对雄性小鼠生殖系统影响及其毒作用机制,有助于我们理解微塑料对男性不育的影响。研究目的前期研究已经发现微塑料可以导致水生生物配子和胚胎的损伤现象以及小鼠肝脏和肠道的炎性变化,并发现这种损伤作用与微塑料所导致的炎症反应和ROS密切相关。因此本研究以ICR小鼠为研究对象,以PS-MPS为实验材料,以PS-MPS所导致的炎性变化为切入点,研究PS-MPS对小鼠生殖系统的影响及其毒作用机制,为男性不育的研究提供新的研究思路。研究方法1.实验研究设计方案:（1）首先建立PS-MPS致小鼠生精异常的动物模型:随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,分别对应的微塑料暴露剂量为0μg/L、100μg/L、1000 μg/L和10 mg/L。小鼠暴露PS-MPS的方式采用自由饮水的方式暴露35d,暴露过程中定时更换PS-MPS悬浮液、定时震摇水瓶,以保证水瓶中的PS-MPS悬浮液保持均质。在暴露的第1天、第8天、第15天、第22天、第29天、第36天分别称量小鼠体重,暴露结束,第36天终止实验,收集小鼠样本进行生殖损伤相关指标检测。（2）选取高剂量作为时间序列模型的暴露剂量,给与小鼠暴露35天,设定6个观察终点,分别于暴露第0w、第1w、第2w、第3w、第4w,第5w终止实验,收集相关样本进行炎性因子、凋亡因子等指标的检测。（3）选取高剂量作为时间序列模型的暴露剂量,给与小鼠暴露,设定6个观察终点,分别于暴露第0h、第6h、第12h、第24h、第48h,第72h终止实验,收集睾丸组织,检测睾丸组织内ROS的水平。（4）GC-2细胞与PS-MPS共培养建立细胞损伤模型:GC-2细胞与PS-MPS共培养,分别在暴露PS-MPS后的0h、6h、12h、18h、24h、36h、48h共七个时间点小时收集细胞蛋白进行相关检测。（5）建立PS-MPS致GC-2细胞DNA损伤模型:GC-2细胞在ML385和PDTC预处理后,给与PS-MPS共培养,24h后,收集细胞进行凋亡检测,同时收集细胞蛋白,检测DNA损伤相关蛋白。2.统计学方法:使用Excel软件对原始数据进行录入,用GraphPad Prism软件对实验结果进行作图处理,用SPSS22.0进行变量间的数据统计学分析,P＜0.05,差异有统计学意义。研究结果最终以均数±标准差来表示。各模型的剂量组之间比较前进行方差齐性检验和正态性检验。符合正态分布的连续型变量,组间差异采用方差分析,两组之间的差异采用Dunnett’s T和Bonferroni分析。研究结果1.PS-MPS暴露后导致雄性小鼠生殖损伤研究结果1.1系统毒性表现:暴露不同剂量PS-MPS后各组小鼠体重没有显著变化,小鼠的肝肾和睾丸系数出现降低、脂肪系数升高;1.2雄性生殖损伤表现（1）精子损伤情况:暴露不同剂量PS-MPS后,小鼠活精子计数出现显著下降,精子畸形增加,精子畸形的类型主要是双尾畸形、颈部膨大和无钩畸形;（2）病理损伤:小鼠睾丸组织切片HE染色后发现,睾丸生精小管内各层生殖细胞排列紊乱、细胞破裂、细胞核固缩、管内精子数减少。（3）睾丸细胞凋亡:①病理学TUNEL染色显示睾丸组织细胞凋亡;②检测凋亡蛋白发现,促凋亡蛋白Bax在暴露PS-MPS后出现显著升高,抑凋亡蛋白Bcl2在暴露PS-MPS后表达显著降低,Bax/Bcl2比值在暴露PS-MPS后显著升高。2.PS-MPS致小鼠生殖损伤机制2.1 PS-MPS暴露致小鼠睾丸组织细胞产生ROSPS-MPS干预小鼠后导致小鼠睾丸组织的ROS水平升高。在72小时的研究过程内,ROS水平在72h以内没有显著的升高,在72h时开始出现显著的升高。为了研究PS-MPS暴露期间ROS的变化规律,建立生精周期内不同时间点检测模型,结果显示,小鼠睾丸组织的ROS水平在暴露PS-MPS后1w时即出现显著的升高,且随着暴露时间的延长,ROS水平持续高于对照组。2.2 PS-MPS暴露致小鼠睾丸组织出现炎症反应①PS-MPS致小鼠睾丸组织炎性通路改变。小鼠睾丸组织炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα表达水平在暴露PS-MPS后显著升高,且调控炎性变化的通路蛋白NF-κB相关蛋白表达升高,而Nrf2相关蛋白表达降低;推测该通路可能参与了 PS-MPS导致的睾丸组织细胞凋亡;②给与NF-κB抑制剂PDTC处理后细胞凋亡减少,给与Nrf2抑制剂ML385处理后凋亡增加,提示PS-MPS通过Nrf2/HO-1/NF-κB炎性通路导致了睾丸组织细胞凋亡;③在动物模型暴露PS-MPS一个生精周期内,炎性因子TNFα和p-NF-KBp65最先发生变化,随着暴露时间的延长,TNFα、IL-1β、p-NF-κBp65的表达显著升高,在第3w和第4w达到峰值。IL-6在第3w开始出现显著升高,第4w达到峰值。细胞实验结果显示,暴露PS-MPS后,TNFα、IL-1β在6h时表达水平显著高于对照组,分别在18h和36h达到峰值;p-NF-κBp65在12h明显下降,18h达到峰值,之后随着时间的变化与对照组比较没有显著差异;PS-MPS致小鼠睾丸组织炎症中敏感的炎性因子TNFα、IL-1β可能参与调控了 Nrf2/HO-1/NF-κB炎性通路。2.3 PS-MPS暴露影响雄性激素合成、损伤血睾屏障①小鼠暴露PS-MPS后,血清中睾酮、FSH、LH表达水平下降;②小鼠睾丸组织类固醇激素合成酶表达减少,睾丸雄激素受体表达下降;③睾丸紧密连接蛋白表达降低,血睾屏障受损;④在动物模型暴露PS-MPS一个生精周期内检测发现,随着暴露时间的延长,紧密连接分子Occludin的表达逐渐降低。在暴露PS-MPS后的第一周即出现了显著的降低,且随着暴露时间的延长,Occludin分子在3w和4w时表达达到了最低值。Caludin-11分子在暴露PS-MPS后的2w才开始出现降低,在5w达到最低水平;⑤血睾屏障损伤与炎症因子的关系:随着炎性因子表达的升高,紧密连接分子Occludin和Caludin-11分子的表达逐渐降低。PS-MPS暴露通过改变激素水平和炎症反应影响睾丸血睾屏障的重塑。2.4 PS-MPS暴露后导致睾丸组织细胞DNA损伤PS-MPS暴露后可导致小鼠睾丸组织DNA损伤;①PS-MPS暴露可导致DNA损伤蛋白γ-H2AX、8-ohdg表达升高,导致参与调节DNA修复的p53蛋白表达升高;er5给与NF-κB抑制剂PDTC,DNA损伤蛋白表达下降,而给与Nrf2抑制剂ML385,DNA损伤蛋白表达升高,说明PS-MPS导致的细胞DNA损伤与炎症通路Nrf2/HO-1/NF-κB有关;③动物时间序列模型检测的ROS与DNA损伤关系,PS-MPS可以导致睾丸组织ROS水平的持续升高的同时,γ-H2AX、P53的表达显著升高,提示DNA损伤与ROS有关;④动物时间序列模型结果显示,PS-MPS导致睾丸组织炎性因子水平持续升高的同时,γ-H2AX、p53的表达显著升高,提示DNA损伤与炎性反应密切有关。研究结论1.PS-MPS暴露可通过NF-κB/Nrf2/HO-1通路介导ICR小鼠睾丸炎症,引起睾丸细胞凋亡,导致雄性生殖损伤;2.PS-MPS暴露可以通过NF-κB/Nrf2/HO-1通路介导的炎症反应导致ICR小鼠睾丸组织和生殖细胞的DNA损伤,进而导致雄性生殖损伤;3.PS-MPS可通过降低血清性激素水平、抑制激素受体的表达以及诱导的炎症反应共同作用导致小鼠血睾屏障的完整性破坏以及雄性生殖损伤的发生。4.PS-MPS导致的雄性生殖损伤可能是睾丸炎症以及炎症参与的DNA损伤、血睾屏障损伤和激素合成障碍共同作用结果。