背景元胡止痛片理气活血止痛,治疗气滞血瘀型痛症,临床疗效显著。本课题组前期通过对其成分定性/定量分析、在体过程分析及其肠吸收液对血管活性的评价,获得其有效成分群；另外,通过网络药理学方法优选其适应症,发现方中多个成分靶向疼痛靶点外,还可能与焦虑、抑郁等靶点相关,但其药效特点及分子机制均不清楚。慢性疼痛分多种亚型,其中神经病理性疼痛是较顽固、难以根治的一种,是由躯体感觉系统的损害或疾病引起的疼痛,影响着超过世界人口5%的人群,且无较好的特效药物。近年来,研究者分别从组方的两味中药——延胡索和白芷中识别多个成分可缓解神经病理性疼痛,且无明显的耐药性和镇静作用。基于以上思考,本研究将着重考察元胡止痛方对神经病理性疼痛的效应特点及其可能的分子机理,为该方临床适应症的拓展及机制的深入研究奠定基础。研究内容本研究从模型建立、药效评价、机理探讨这3个部分展开。第一部分,坐骨神经慢性压迫损伤模型(Chronic construction injury, CCI)模型建立左侧坐骨神经主干4道较松结扎,制备CCI模型,通过行为学观察和疼痛行为检测评价模型的稳定性,并以临床治疗常用药物——加巴喷丁作为阳性药,说明模型的有效性。第二部分,元胡止痛方提取物(Yuanhuzhitong prescription, YZP)药效评价CCI手术造模后,立即连续灌胃14天不同剂量的YZP (0.04g/kg.0.12 g/kg、 0.36g/kg、1.08 g/kg)、第一阳性药加巴喷丁(gabapentin, gab) (100mg/kg)、第二阳性药颅痛定(Lutongding, LTD) (36 mg/kg),观察给药期间及停药1周内的机械痛阈值和热痛阈值变化,探究YZP干预神经病理性疼痛的作用特点。第三部分,分子机理研究在前期模型和药效稳定的基础上,确定术后第10天作为分子机理研究的取材时间点,该部分分为两个部分。首先,测定脑脊液中氨基酸,即椎骨大孔穿刺取脑脊液,测定各组脑脊液中4种氨基酸(谷氨酸GLU、谷氨酰胺GLN、亮氨酸LEU和色氨酸TRP)的含量,筛选神经病理性疼痛在体检测的生物标志物。其次,检测背根神经节(dorsal root ganglia, DRG)中差异表达的miRNAs及其靶标mRNAs,即提取DRG中总RNA,分别应用于miRNA芯片和Gene芯片,高通量筛选药物干预作用下潜在差异表达的miRNAs和mRNAs,并通过miRTarBase和Targetscan预测miRNA调控的靶基因,再与芯片筛选实测得到的mRNA取交集,获得miRNA与mRNA靶向对应关系,通过文献梳理筛选,最终获得在YZP治疗神经病理性疼痛中可能起关键作用的候选miRNA及其靶标mRNA。研究结果第一部分,CCI模型建立CCI模型手术侧机械痛阈值和热痛阈值从第3天开始显著下降(p<0.05),第10天左右降至阈值最低点,并能在21天内稳定维持,且造模成功率稳定在80%左右。第二部分,YZP药效评价从机械痛敏角度来看,不同剂量的YZP均在术后第5天开始起效并维持效应(YZP2、YZP3、YZP4、p<0.01;YZP1,p<0.05),且在起效时痛阈值改善与剂量即呈正相关性,在给药期间内稳定维持,停药后作用均减弱,YZP 1在停药后第2天镇痛效应消失,YZP3在停药后第4天起未见镇痛效应(p>0.05),而YZP2’YZP4在停药后第7天药效才消失(p>0.05)；阳性药gab和LTD在术后第7天左右开始起效,并在给药期间内稳定维持,停药后阈值逐步下降,停药后第4天开始对CCI诱导的机械痛阈值的改善作用消失。从热痛敏角度来看,给药一周内,YZP对CCI诱导的热痛阈的影响波动较大且与模型组比较并无显著性差异(p>0.05),术后第10天不同剂量YZP开始起效并在给药期间内平稳维持(p<0.01),与给药量间存在一定的正性相关性,停药后阈值缩短,停药后第4天除了YZP3剂量组(p<0.05),其他剂量均无显著的镇痛作用；给药一周内,阳性药gab和LTD对CCI诱导的热痛阈较模型组无明显区别(p>0.05),第10天开始起效并在给药期间内显著性地提高热痛阈值(p<0.01),停药后第4天未观察到镇痛效应。而给药14天内,灌胃不同剂量YZP、gab、LTD对手术对侧的机械痛阈值和热痛阈值几乎无影响(p>0.05)。第三部分,分子机理研究首先,模型组与假手术组比较,动物脑脊液中4种氨基酸中仅LEU含量显著增高(p<0.05)；给予阳性药gab可逆转这一过程(p<0.01),但阳性药LTD和YZP不同剂量对CCI诱导的LEU含量增高并无明显改善作用(p>0.05)。其次,miRNA芯片筛选获得32个差异表达的miRNA, Gene芯片筛选获得120个差异表达的mRNAs,通过miRNA预测得到的靶标mRNA,再与差异表达mRNA交集并筛选负相关性的miRNA-mRNA15对,通过文献调研,发现其中5对可能与疼痛通路特别相关,分别是miR-301a与CASR、miR-301a与NPTX1、 miR-96-3p与NPTX1、 miR-411-3p与AKAP5、miR-543-5p与AKAP5。结论1.本研究成功复制出CCI模型，在此基础上证实元胡止痛方不同剂量组均可改善CCI诱导的机械痛敏和热痛敏,且呈一定的剂量依赖趋势。2.CCI造模后,动物脑脊液中4种氨基酸含量并无明显变化,除了LEU,给予gab可逆转LEU的升高,而YZP和LTD对其无影响,提示YZP可能并不通过调节脑脊液氨基酸含量而发挥镇痛效应。3.YZP治疗神经病理性疼痛可能作用于背根神经节中miRNAs,由miRNAs调控其靶基因而发挥效应,特别是miR-301a与CASR、miR-301a与NPTX1、miR-411-3p与AKAP5、miR-543-5p与AKAP5、miR-96-3p与NPTX1。