内源性ALV的全基因测序、J-ALV实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hjm19840220
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本研究根据NCBI上ev-1设计了相应的引物,从商品蛋鸡中扩增出一株内源性E亚群,经测序发现从正常商品蛋鸡中扩增出的ALV-E亚群序列与ev-1(E)同源性达99.1%,与SD0501(E)同源性98.9%,而与HPRS103和NX0101同源性为85.4%。与ev-3只有54.8%的同源性。本研究为研究禽白血病J亚群病毒在鸡体内各个器官的病毒分布,建立了荧光定量PCR检测方法。根据禽白血病病毒J亚群NX0101毒株基因5257-5510bp的碱基序列,设计了1对特异性引物,进行RT-PCR反应,扩增产物为253bp,同时按照参考文献,合成1对β-actinPCR引物作为内参,进行RT-PCR反应,扩增产物为139bp。将ALV-Jenv基因和(3-actin扩增产物与PMD-18-T载体重组,构建的重组质粒分别命名为PMD-18-J和PMD-18-p,测序成功后作为Real-time PCR反应的标准模板。利用上述引物和SYBR Green I染料进行Real-time PCR反应,建立了标准曲线,并进行反应灵敏性、特异性和重复性试验。试验结果表明:标准曲线线性关系R值均为0.9914,检测极限约为100拷贝质粒DNA;特异性分析表明只有禽白血病病毒能检测到特异性的熔解度峰值;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。本研究所建立的ALV-J基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,为研究禽白血病J亚群病毒在畜禽体内各个器官的病毒分布奠定了基础。然后用已建立的实时荧光定量RT-PCR方法对人工感染ALV-J后8周龄的SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、腺胃分别提取RNA反转录成CDNA后进行荧光定量PCR的检测。根据标准曲线公式计算出J基因和β-actin的拷贝数,然后根据公式:ALV-J相对表达量=ALV-J拷贝数/β-actin拷贝数计算ALV-J的相对含量。通过比较数值得出可以得出法氏囊中ALV-J基因的相对含量最高,脾脏和胸腺次之,肝脏和腺胃第三,两者之间也无差异,心脏含量最低。针对实验室送诊ALV病例,采用上述方法对各个器官进行荧光定量PCR检测,具有血管瘤症状自然感染鸡只的胸腺中ALV-J的相对含量最高,其他器官依次是法氏囊>肾脏>腺胃>脾脏>肝脏>肺脏,心脏含量最低。此鸡只的器官与实验组人工感染的SPF鸡比较,肾脏和胸腺的含量高于SPF鸡,其余器官都低于SPF鸡。另外肝脏有肉眼可见肿瘤结节的自然感染鸡中肝脏的ALV-J基因的相对含量最高;胸腺、法氏囊、脾脏次之,但是三者之间无差异性;肾脏、肺脏、腺胃居第三,三者之间无差异性;心脏含量也是最低的。本研究利用SYBR Green I荧光定量PCR对鸡体内器官进行ALV-J基因的分布的研究表明,临床发病鸡群各组织中ALV总含量显著高于未出现病变的人工感染鸡群。
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