论文部分内容阅读
叶片是植物进行光合作用和感知外界环境变化的重要器官,对植物的生长发育具有重要作用。叶片的整个生命过程可分为叶原基起始、极性建立、生长发育及衰老等四个阶段,而这些过程的进行需要依赖于转录因子的精细调控。本文主要研究了拟南芥AtNACx和AtbHLHα转录因子分别在叶片衰老与发育过程中的功能与作用机理。本文研究发现拟南芥中AtNACx调控叶片衰老。AtNACx是一个含有跨膜区的转录因子,其表达受冷害、热害、盐害及脱落酸(ABA)的诱导。AtNACx的亚细胞定位显示其定位于内质网上,而去掉跨膜区的AtNACx-△TM定位在细胞核中。qRT-PCR分析发现,AtNACx在叶龄依赖和黑暗诱导的叶片衰老过程中,转录本水平逐渐下降,只在叶龄依赖的衰老后期才出现上调。通过对AtNACx的T-DNA插入功能获得性突变体进行表型分析,我们发现在叶龄依赖和黑暗诱导的衰老中,nacx均比野生型拟南芥WT衰老延迟,叶绿素含量相对较高。在叶龄依赖的衰老中,AtNACx-RNAi株系与WT没有明显区别,但在黑暗诱导的衰老中比WT衰老的快,叶绿素含量降低。在拟南芥幼苗中,AtNACx-△TM的诱导表达能够促进活性氧(ROS)的累积和DNA片段化。在衰老的表型分析中,发现AtNACx-△TM的诱导表达能够迅速地引起拟南芥叶片衰老和ROS的累积。通过qRT-PCR及双荧光素酶报告系统(Dual LUC)分析发现,AtNACx-△TM能够激活AtRBOHD、AtRBOHF、AtZAT12、AtAOX1a、AtSAG12、AtSAG29、AtNCED3以及AtDREB2B等基因的表达。进一步通过电迁移滞后分析(EMSA)试验发现,AtNACx的NAC结构域能够直接与AtSAG12和AtSAG29的启动子区域结合。与此同时,还发现在烟草叶片中瞬时表达AtNACx-△TM能够引起烟草叶片发生类似于超敏反应的细胞死亡和ROS的累积,并引起ROS和防御相关基因的表达。其次,本文对实验室前期工作中发现的AtbHLHα的调控机理进行了深入研究,AtbHLHα的过表达株系叶片呈锯齿状。首先,通过亚细胞定位和转录活性分析,发现AtbHLHα转录因子定位于细胞核且具有转录激活活性。其次,本文发现AtbHLHα能分别与自身和与其同源的AtbHLHβ形成同源和异源二聚体,而且AtbHLHβ能够抑制AtbHLHα的转录激活活性。在对AtbHLHα的突变体及转基因株系进行表型分析时发现,在突变体bhlhα-2中过表达AtbHLHα时,叶片发育异常的表型更加突出,例如有些株系叶片呈纤维状。进一步研究发现,AtbHLHα能够分别与拟南芥LBD(lateral organ boundaries)转录因子家族中的AtJLO、AtLBD18、AtLBD25以及AtLOB互作,并且AtJLO、AtLBD18和AtLOB能够抑制AtbHLHα的转录激活活性。另外,双分子荧光互补(BiFC)试验发现AtbHLHβ也能分别与AtLBD18、AtLBD25、AtLOB互作。更有趣的是,本文还发现AtbHLHα还能分别与叶近轴极性建立有关的AtAS1(MYB91)和AtAS2转录因子互作,并且能够调控下游基因AtBP1的表达。以上结果表明,AtbHLHα可能通过分别与AtJLO、AtLOB、AtAS1以及AtAS2之间的互作参与叶发育与形态建成。