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本实验从蛹草拟青霉EST数据库中开发SSR标记,共设计了40对引物,经过初步筛选后有39对可以扩出目的片段,最终获得31对具有多态性的EST-SSR引物。随后进一步选取其中的9对引物对拟青霉属5个种18个居群材料进行遗传多样性检测。此外,在拟青霉属的近缘属被毛孢属进行了转移性研究,并进行引物筛选和遗传多样性分析。实验结果如下:
对4596条从NCBI下载到的蛹草拟青霉EST序列进行分析,获得无冗余序列1363条。其中通过拼接EST序列得到的Contig序列454条,单一EST序列(Singlet)909条,平均冗余率29.66％。从无冗余序列中挖掘到1117个EST-SSR位点,分布于1088条EST序列中。SSR位点出现频率为24.30％。主要的重复单元为单碱基重复,共931个,出现频率为83.35％,其中最多的基序为A和T。
9对SSR引物在所有供试的拟青霉属材料中均能扩出清晰的目的条带,共获得184条清晰条带,平均每组引物扩增所得多态条带为20.44。随后的聚类分析显示,18个居群的拟青霉材料可以分成4个组,其中12个居群蛹草拟青霉‘PMA’,‘PMB’,‘PMC’,‘PMD’,‘PME’,‘PMF’,‘PMG’,‘PMH’,‘PMI’,‘PMJ’,‘PMK’和‘PML’聚在一起,相似系数很高,证实了它们具有较近的亲缘关系。另外,测序的比对结果表明SSR的侧翼序列是保守的,微卫星在所有的引物中都存在。
上述的39对引物在被毛孢属材料中可以扩增出目的产物为31对,其中多态性引物17对,又随机选取8对在4个种的13个居群被毛孢属材料上进行了扩增。所选引物在这些材料上都扩增出了与在拟青霉属上大小相似的预期产物,共获得151个条带,平均每组引物扩增所得多态条带为18.88.聚类分析显示,本实验中被毛孢属所有居群总的分成了3组,其中8个中国被毛孢居群交错聚为一枝,揭示了他们之间较近的遗传关系。