研究背景：尼克酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide Phosphoribosyltransferase, NAMPT),是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)补救合成途径中的限速酶,这是哺乳动物合成NAD的主要途径。NAMPT在全身多种细胞表达,而在脑内主要表达于神经元以及血管内皮细胞,NAMPT也可以分泌到细胞外包括血清中起作用。细胞内NAMPT主要起调节细胞内NAD水平的作用,而细胞外NAMPT被认为是一种细胞因子,参与许多的反应包括介导炎症、氧化应激等。缺血性脑卒中是一种年龄相关的疾病,能引起神经功能的损伤,具有高致死和致残率。在缺血性脑卒中引起的损伤中,除了神经细胞受到损伤外,也有非神经细胞的损伤,包括脑血管内皮细胞和胶质细胞。脑血管内皮细胞对缺血非常敏感,在急性脑缺血发生后,就会出现脑血管内皮细胞的功能障碍,导致血脑屏障通透性增加,引起血管性水肿,随后出现血管痉挛和加重缺血损伤。内皮细胞介导的血管再生对脑缺血后的恢复也起了非常重要的作用。因此脑血管内皮细胞也是缺血性脑卒中后很重要的治疗靶细胞。研究表明,缺血性脑卒中患者血清的NAMPT也显著增加。在大鼠脑缺血模型中,降低NAMPT的表达会导致缺血损伤加重,而增加NAMPT表达或者给予NAMPT直接产物NMN则对脑缺血具有保护作用。NAMPT能通过酶活性增加细胞内NAD的水平,抑制脑缺血引起的线粒体膜电位的下降从而对缺血后的神经元产生保护作用。NAMPT的终产物NAD已经被认为是一种神经保护剂,在脑缺血导致的神经元死亡和轴突变性中都具有保护作用。这些研究提示NAMPT可以成为有效预防和治疗缺血性脑卒中的靶点。研究已经发现NAMPT在维持外周血管内皮细胞正常功能和血管重塑中起了非常重要的作用.NAMPT能促进内皮细胞的增殖、迁移和管样形成,因此,NAMPT被认为是一种促血管再生因子。NAMPT对内皮细胞还具有抗凋亡、抗衰老等保护作用,此外,也有体内和体外实验认为NAMPT与内皮细胞的炎症反应有关。我们的研究也发现,在老年小鼠脑中细胞内NAMPT明显降低,血清中的NAMPT显著增加,而血清中的NAMPT作为重要的细胞外NAMPT,直接作用于脑血管内皮细胞。另外,已经有较多的临床研究发现,糖尿病、肥胖等代谢性疾病患者的血清NAMPT显著增高,而众所周知,这些疾病患者好发缺血性脑卒中,同时脑卒中发生后的脑损伤也明显比非代谢性疾病患者严重。那么这种细胞内NAMPT降低,细胞外NAMPT增高的情况是否对脑血管内皮细胞生理功能有影响?细胞内外的NAMPT变化对脑缺血后引起的脑血管内皮细胞损伤是否有影响,若有,是具有保护作用呢还是具有加重损伤的作用?具体是通过何种分子机制?这些问题都尚需进一步阐明。研究目的：本文拟观察细胞内外NAMPT对小鼠脑血管内皮细胞的生理功能有何影响,阐明细胞内NAMPT对脑缺血后引起的脑血管内皮细胞损伤的作用,揭示细胞内NAMPT影响脑血管内皮细胞的作用机制,包括：第一部分：NAMPT对脑血管内皮细胞生理功能的影响；第二部分：细胞内NAMPT对脑血管内皮细胞缺血后损伤的影响。研究方法：本文以小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3细胞为主要研究对象,以NAMPT抑制剂FK866抑制细胞内NAMPT的作用,NAMPT直接产物NMN模拟NAMPT增加,重组的人NAMPT和突变后失去酶活性的NAMPT/H247A模拟细胞外NAMPT增加,以缺氧缺糖模型(oxygen-glucose deprivation, OGD)为离体脑缺血性损伤模型,以OGD0.5h和OGD4h诱导缺血性损伤。免疫荧光染色法和免疫印迹法检测NAMPT在脑血管内皮细胞的表达；MTT、LDH法检测细胞活性及损伤程度；细胞划痕方法检测细胞迁移；细胞计数检测细胞数量以评价细胞增殖；PI-Hoechst染色检测细胞凋亡和坏死；大鼠主动脉环血管再生模型评估血管再生；NAD/NADH试剂盒检测细胞内NAD变化；免疫荧光法检测细胞自吞噬。研究结果：第一部分NAMPT对脑血管内皮细胞生理功能的影响在bEnd.3细胞中,用免疫荧光和免疫印迹的方法检测到有NAMPT的表达。用FK866抑制bEnd.3细胞内NAMPT,发现FK86610nM作用24h即能明显降低细胞内NAD的水平,NMN1mM能完全补充FK866引起的NAD的减少,而单独NMN对细胞内NAD没有影响。MTT和细胞迁移实验的结果发现,FK86610-100nM能浓度依赖和时间依赖的抑制细胞的增殖和迁移,高浓度FK866还可以促进细胞的凋亡。而NAMPT直接产物NMN0.1-1mM能浓度依赖的逆转FK866的作用,单独NMN对细胞细胞活性和迁移均没有明显的影响。在大鼠主动脉环新生血管形成的实验中,我们发现FK86610nM虽然没有影响新生血管的数量,但是能够明显抑制内皮细胞的迁移,而FK866100nM则能明显抑制新生血管的生长。这些结果表明,细胞内NAMPT通过调节NAD合成参与脑血管内皮细胞的重要生理功能,是脑血管内皮细胞生存和维持正常功能所必需的。此外,我们在细胞外给予人重组NAMPT和突变后失去酶活性的NAMPT/H247A,发现在0.1-1.0μg/ml作用不同时间(24-72h)可以促进脑血管内皮细胞的增殖和迁移,这一结果说明,细胞外NAMPT可以促进脑血管内皮细胞的增殖和迁移,并且其作用可能与NAMPT的非酶活性相关。第二部分细胞内NAMPT对脑血管内皮细胞缺血后损伤的影响我们对bEnd.3细胞OGD0.5h,发现bEnd.3细胞活性下降20%左右,但是LDH释放和细胞数量没有明显改变,细胞活性在复灌24-48h逐渐恢复正常,提示OGD0.5h仅造成细胞轻度的一过性损伤。在24-48h的复灌过程中,细胞内NAD水平逐渐下降,FK866预给药可以进一步减少细胞内NAD的水平,而NMN能在OGD后补充细胞内NAD。在OGD前24h预先用FK86610nM消耗细胞内NAD可以加重OGD0.5h引起的细胞活性下降,而NAMPT的直接产物NMN可以完全逆转FK866预给药引起的细胞活性下降,但是不能缓解单独OGD0.5h引起的细胞损伤。OGD后给予FK866或者NMN对细胞活性的恢复均无显著影响。这一结果表明,脑血管内皮细胞内NAD水平的降低可以加重细胞对轻度缺血性损伤的易感性,但NAD不参与轻度OGD损伤后的脑血管内皮细胞恢复。OGD4h导致bEnd.3细胞活性下降50%左右,同时伴LDH释放增加和细胞数量的减少,提示有明显的细胞损伤,细胞内NAD水平在OGD4h复灌24-48h有增加趋势。FK866可显著降低复灌后细胞内NAD水平,但NMN对OGD后及复灌过程细胞内NAD水平均无影响。FK8661-10nM对OGD后及复灌过程的细胞活性下降、LDH释放均无影响,但是给予NAMPT直接产物NMN1mM可以使OGD4h及复灌24-48h的脑血管内皮细胞活性增加、OGD后的LDH释放减少。这一结果说明,在重度脑缺血损伤时,NMN对缺血后及复灌过程的脑血管内皮细胞具有保护作用。最后对细胞内NAMPT在缺血损伤时的作用机制进行了探讨,我们发现FK86610nM作用48h和OGD4h都能明显增加脑血管内皮细胞的自吞噬,而NMN1mM和自吞噬抑制剂LY294002都能抑制FK866及OGD4h引起的自吞噬的增加,但是FK866不能加重OGD4h引起的细胞自吞噬的增加。这一结果提示,细胞内NAMPT在脑缺血后对脑血管内皮细胞的作用机制可能部分与自吞噬相关。结论：1.细胞内NAMPT通过合成NAD参与脑血管内皮细胞的重要生理功能,是脑血管内皮细胞生存和维持正常功能所必需的；细胞外NAMPT可以促进脑血管内皮细胞的增殖和迁移,其作用可能与NAMPT的非酶活性相关。2.在轻度缺血性损伤时,抑制细胞内NAMPT活性可以减少细胞内NAD水平,增加脑血管内皮细胞对损伤的易感性；在重度缺血性损伤时,增加细胞内NAMPT,补充细胞内NAD,可以对脑血管内皮细胞起保护作用；细胞内NAMPT对脑血管内皮细胞缺血性损伤的作用机制部分与自吞噬相关。