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目的观察质粒载体介导的shRNA干扰技术能否有效抑制人子宫内膜癌细胞株Ishikawa HER-2基因的表达。RT-PCR法检测实验组和对照组之间转染后mRNA水平之间是否有差异。Western Blot法检测实验组和对照组之间转染后P185蛋白表达是否有差异。材料及方法Ishikawa细胞购自于湘雅医学院细胞研究所。利用Ambion公司提供的RNAidesign tool设计出两条针对HER-2/neu基因的特异性短发夹状RNA(shRNA),GC比率在45%到55%之间。选用pSilencer4.1-CMV vectors(Ambion)作为质粒载体,构建两条针对HER2基因的特异性重组质粒。首先进行细胞传代,传至足够数量的细胞后冻存备用。利用大肠杆菌JM109作为感受态菌进行大量的质粒扩增,以储备足够数量的质粒,用lp2000作为媒介转染Ishikawa细胞。试验分为三组,即shRNA-HER2-1组、shRNA-HER2-2组和表达非特异短发夹状shRNA-CON的真核表达载体的阴性对照组。三组shRNA的真核表达载体转染人子宫内膜癌Ishikawa细胞后,RT-PCR法检测转染后24、48、72h HER2基因mRNA的表达。Western Blot法检测转染后24、48、72h HER2基因P185蛋白的表达,对比三组之间的差异。结果经鉴定证实真核表达载体shRNA-HER2-1、shRNA-HER2-2与shRNA-CON均构建成功。RT-PCR结果表明,在转染后24h、48h及72h后Her-2/neu1与Her-2/neu2组的mRNA水平分别下降为非特异Her-2/neu con组的70.1%和80.2%、60.2%和71.2%以及69.3%和78.5%,证实了两特异重组质粒在mRNA水平上均能抑制her-2基因的表达。而Western Blot法检测P185蛋白水平分别下降为非特异Her-2/neu con组的79.1%和82.3%、57.2%和67.8%以及68.4%和73.3%,亦证实了两条特异链在蛋白水平的抑制作用。相比较1链的抑制作用更为明显。结论1、两个shRNA-HER2与阴性对照shRNA-CON真核表达载体构建成功;2、shRNA-HER2-1、shRNA-HER2-2均可在mRNA水平有效抑制Ishikawa细胞HER2基因的表达。3、shRNA-HER2-1、shRNA-HER2-2均可有效抑制P185蛋白的表达。4、RNA干扰技术为子宫内膜癌基因治疗提供了新策略。