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溶酶体(lysosome)内包含大量水解酶,主要为核酸酶、脂酶、糖苷酶和蛋白酶。这些酶参与代谢细胞内的代谢物。如果这些酶出现病变,代谢中间产物会在溶酶体中大量积累,目前有50种与溶酶体中间代谢产物积累相关的疾病,这些疾病成为溶酶体贮积症(lysosomal storage disease)。治疗溶酶体贮积症的方法之一是注射可以被细胞表面甘露糖-6-磷酸受体(M6P receptor)识别,带有甘露糖-6-磷酸糖链结构的糖蛋白。用人肾胚HEK293细胞生产该药物分子可以避免免疫原性的问题,但糖蛋白上糖链不均一性是受体识别效率低的主要原因。为了解决这一问题,本研究构建了可以生产高比例的高甘露糖型糖蛋白和低比例的复合型糖蛋白的细胞株。首先在HEK293细胞中敲除(Knock Out,KO)了两个高尔基体(Golgi)α1,2-甘露糖苷酶Ⅰ的控制基因(MAN1A1和MAN1A2)。结果显示单敲细胞株MAN1A1KO-24和MAN1A2KO-37中的N-糖链结构几乎没有发生改变,而在MAN1A1和MAN1A2双敲细胞(Double KO,D-KO)中,与野生型对比凝集素ConA-FITC染色后信号增加为野生型的四倍,高甘露糖型N-糖链增加,PHA-L4-FITC凝集素染色信号下降15%,复合型N-糖链减少。但复合型N-糖链依然在D-KO细胞中被检测存在,为了清除剩余的复合型N-糖链,在筛选了人源细胞中与N-糖链合成途径可能存在关联的α1,2-甘露糖苷酶Ⅰ基因后,发现敲除一个编码内质网(ER)α1,2-甘露糖苷酶Ⅰ基因(MAN1B1)可以减少几乎所有复合型糖链。在这个三敲细胞株(MAN1A1、MAN1A2和MAN1B1的Triple KO,T-KO)中,相较于野生型细胞,ConA-FITC染色后信号增加为野生型的5.3倍,高甘露糖型糖链比例相较于D-KO进一步增加,凝集素ConA-FITC染色后信号与背景几乎相同,远低于野生型数值。同时对野生型、D-KO细胞和T-KO细胞进行全细胞糖链分析,野生型存在至少27种不同类型糖链,D-KO细胞依然存在复合型糖链,在T-KO细胞株中则不能检测到复合型糖链。利用三敲细胞(T-KO)表达重组溶酶体蛋白α-半乳糖酶A(GLA)和溶酶体酸性脂肪酶(LIPA),免疫印迹(Western Blot)结果显示在T-KO细胞中表达的重组溶酶体蛋白上的糖链对糖苷酶EndoHf处理敏感,暗示T-KO细胞表达的GLA和LIPA蛋白上的N-糖链为高甘露糖型糖链。同时使用野生型细胞和T-KO细胞表达人源重组蛋白EGFPFLAG-HyHEL10和溶酶体酸性脂肪酶后,通过MALDI-TOF飞行质谱对蛋白上糖链进行分析,在野生型中抗体分子上糖链主要为复合型,T-KO细胞中为高甘露糖型。野生型细胞溶酶体酸性脂肪酶分子上糖链既有复合型又有高甘露糖型,而T-KO细胞则全部为高甘露糖型,并且主要为Man9-GlcNAc2和Man8-GlcNAc2的形式。结果证明T-KO细胞可以用于高甘露糖型溶酶体蛋白的生产。