目的:随着生活水平的不断提高,缺血性心脏病已成为全球死亡的首要原因。近年来的研究发现,心肌缺血后可以触发新生血管形成。而新生血管的形成可以改善缺血区的血液供应。有效的再灌注治疗在早期由于提高了血液供应,从而减少心肌坏死,有助于维持正常的心功能。同时对于预防晚期的左室重塑所致的心衰也至关重要。尽管十几年来,治疗手段发展迅速,但是缺血性心脏病的治疗效果仍不能令人满意。这就促使人们研究新的治疗方案。促血管生成疗法,在促进心肌再灌注治疗效果和提高缺血心肌功能方面的作用,也日益受到重视。关于血管新生的机制目前仍不完全清楚。根据已有的研究结果来看,这是一个涉及到多因素,多阶段的复杂过程。除了低氧诱导因子,生长因子,干细胞/祖细胞外,非编码RNA已经被证实参与了血管新生。在人类基因组中,98%左右的基因都是转录成非编码RNA。其中长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）的功能和作用机制近年来备受关注。目前研究发现lncRNA在基因转录、组蛋白修饰和DNA甲基化等多种生物学过程中都发挥着调控作用。lncRNA与心血管系统的发育,正常生理功能的维持以及病理状态的变化关系密切。在心肌梗死,心衰,肥厚性心肌病等病理情况下,均可以发现lncRNA表达水平的变化。RNAs之间彼此存在相互作用,构成了一个复杂的网络系统,在转录后水平上调控基因的表达。在一系列实验证据的支持下,2011年提出了竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）假说。该假说主要内容是指不同的RNAs转录本含有相同的MREs（miRNA response element）,彼此之间竞争与相应的miRNA结合,互为ceRNA。新近的研究中,发现一种lncRNA,它显示出了进化上的高度保守性,由于是在DNA损伤后诱导产生的,又称为NORAD（noncoding RNA activated by DNA damage）。NORAD在细胞质内含量丰富,且表达于多种组织和细胞系内。NORAD的失活,可以导致细胞的有丝分裂缺陷,且四倍体细胞增多,细胞内的染色体数目多变。即使是二倍体细胞,也显示了不同的染色体数目,提示了一种染色体不稳定的表型。表明lncRNA NORAD可能影响细胞有丝分裂,增殖等相关功能。但是目前为止,对于lncRNA NORAD功能的认识还是比较有限的。综上所述,本论文旨在研究lncRNA NORAD在缺氧情况下对内皮细胞功能的影响及其可能的作用机制。鉴定参与此过程的关键因子,为缺血性心脏病的治疗提供新的靶点和策略。研究方法:原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）购自上海中乔新舟生物科技有限公司。经过传代培养后选择第三代到第十代的细胞进行实验。在缺氧实验部分,探讨缺氧的环境对于人脐静脉内皮细胞活力,迁移,小管形成能力以及不同RNAs转录本表达水平的影响。设置常氧和缺氧的培养环境。应用三气培养箱,设置常氧的培养条件5%CO₂,21%O₂,37°C。设置缺氧的培养条件1%O₂,5%CO₂,94%N₂,37°C。将人脐静脉内皮细胞分别于缺氧和常氧的环境下培养24h后,通过CCK-8实验检测内皮细胞的活力情况,transwell实验检测细胞的迁移能力的变化,Matrigel基质胶成管实验用来检测缺氧对于内皮细胞小管形成能力的影响。qPCR实验检测缺氧对于lncRNA NORAD,miR590-3p以及HIF-1α的表达水平的影响,Western Blot实验检测HIF-1α蛋白水平的变化。在转染实验部分,所有细胞转染后均置于缺氧的环境下培养24h。为了检测在缺氧的环境下lncRNA NORAD对内皮细胞功能的调节,分别转染shNORAD,共转染shNORAD+NORAD_1-2000-OE后,qPCR检测lncRNA NORAD,miR590-3p表达水平的回调性变化。同时检测内皮细胞的活力,迁移以及小管形成能力的相应恢复性变化。为了验证lncRNA NORAD通过调控miR590-3p影响内皮细胞的功能,分别转染miR590-3p mimics,共转染shNORAD+miR590-3p inhibitor后qPCR检测lncRNA NORAD和miR590-3p表达水平的回调性变化。同时检测内皮细胞的活力,迁移以及小管形成能力的相应恢复性变化。双荧光素酶报告实验验证lncRNA NORAD与miR590-3p的直接结合。为了检测lncRNA NORAD/miR590-3p轴对下游靶基因的作用,分别转染shNORAD,共转染shNORAD+miR590-3p inhibitor后,分别用qPCR及ELISA检测VEGFA,FGF1,FGF2的表达水平和相应的回调变化。最后双荧光素酶报告实验验证VEGFA,FGF1,FGF2是miR590-3p的直接作用的靶基因。结果:在缺氧实验部分,将内皮细胞分别于常氧和缺氧的环境下培养24小时后,CCK-8实验检测结果显示缺氧可以提高内皮细胞的活力,transwell结果表明,缺氧时内皮细胞的迁移能力增强。Matrigl基质胶成管实验的结果表明缺氧可以促进内皮细胞的小管形成能力。收集细胞分别进行qPCR检测和Western Blot实验,通过分析显示,缺氧时lncRNA NORAD和HIF-1α的表达水平上调,而miR590-3p的表达水平下调。在转染实验部分,我们通过生物信息学预测miR590-3p可能是lncRNA NORAD的作用靶点。转染shNORAD之后,共转染shNORAD+NORAD_1-2000-OE,收集细胞进行qPCR检测,结果显示已经上调的miR590-3p表达水平出现向下的回调性变化。同时抵消了对内皮细胞活力,迁移以及小管形成能力的抑制作用。该结果提示在缺氧的情况下,lncRNA NORAD可以调控内皮细胞的部分生物学功能。之后我们转染了miR590-3p mimics,qPCR检测miR590-3p的表达水平,分别用CCK-8实验,transwell实验,Matrigel基质胶成管实验,检测内皮细胞的活力,迁移以及小管形成能力,其结果与敲低lncRNA NORAD的效果一致。共转染shNORAD+miR590-3p inhibitor后,抵消了miR590-3p表达水平的上调性变化。同时减轻了对内皮细胞活力,迁移以及小管形成能力的抑制作用。双荧光素酶报告实验验证miR590-3p mimics可以降低NORAD野生型报告基因的荧光素酶活性,而对于突变型没有明显影响,提示了lncRNA NORAD与miR590-3p的直接结合作用。上述结果证实了在缺氧的情况下,lncRNA NORAD通过调节miR590-3p表达,影响内皮细胞的功能。我们再次通过生物信息学预测VEGFA,FGF1,FGF2可能是miR590-3p的潜在靶基因。分别转染shNORAD,共转染shNORAD+miR590-3p inhibitor后,qPCR及ELISA结果显示,已经下调的VEGFA,FGF1,FGF2表达水平,出现向上的回调性变化。双荧光素酶报告实验表明VEGFA,FGF1,FGF2是miR590-3P的直接作用靶基因。结果表明缺氧的情况下,lncRNA NORAD通过miR590-3p调控VEGFA,FGF1,FGF2的表达,从而影响内皮细胞的血管新生能力。结论:缺氧情况下,由于lncRNAN NORAD的表达水平上调,导致人脐静脉内皮细胞的活力,迁移,小管形成能力增强。lncRNA NORAD可能是通过负性调控miR590-3p的表达水平,从而干扰VEGFA,FGF1,FGF2的表达,影响人脐静脉内皮细胞的功能。表明lncRNA NORAD-mi R590-3p-VEGFA/FGF1/FGF2轴在缺氧时的血管新生过程中发挥关键作用。