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目的：日本血吸虫病是一种严重危害人类健康的寄生虫病,目前我国沿长江流域的湖南、湖北、江西、安徽和江苏等地仍有流行,被认为是一种免疫性疾病,当前多采用免疫学方法进行疫情的监测和诊断,以检测血清中特异性抗体为主。长期以来,所用检测抗原主要是虫体或虫卵粗抗原,与并殖吸虫、旋毛虫等寄生蠕虫间存在不同程度的免疫交叉反应,特异性低,从而影响了血吸虫病诊断的特异性。但有研究者从免疫学诊断的非特异性出发,从异源生物的交叉反应组分中鉴定出对血吸虫病有诊断价值的抗原,例如匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin,KLH)、蚯蚓和水蛭的一些抗原组分。猪蛔虫(Ascaris suum,As)相对于血吸虫也属于异源生物,与血吸虫存在交叉反应,但对其研究甚少。本实验初步探讨猪蛔虫可溶性蛋白(As soluble protein,Assp)应用于血吸虫病诊断的价值,试图为血吸虫病的诊断研究提供一种新思路。 方法：1. Assp及其免疫血清的制备 (1)Assp的制备 取新鲜As10条洗净剪碎,再用组织粉碎器粉碎,然后在碾钵体内碾成糊状后转移至组织匀浆器内研磨至浆状后取出,4℃10000r/min离心30min后取上清液再次以上述同等条件离心,取上清液即粗提的Assp(记作Assp-1)。再按照改良饱和硫酸铵法提纯Assp,得到的溶液即为纯化的Assp(记作Assp-2)。 (2)Assp免疫血清的制备 取新西兰兔2只,采用常规免疫方案经兔背部多点皮下注射进行免疫。首次免疫后第45d心脏采血,常规方法分离血清获得Assp免疫兔血清。 2. Assp与SEA蛋白组分的分析 运用SDS-PAGE、Western blot分析Assp-1、Assp-2与SEA的蛋白组分及其具有免疫活性的蛋白组分。 3. As抗原模拟表位的筛选 运用噬菌体肽库展示技术(phage display technique,PDT),以As-Ig为靶分子,原肽库扩增的第三轮肽库为源肽库进行第一轮筛选,将第一轮筛选后所得到的洗脱液继续以As-Ig作为靶分子进行第二轮筛选,得到As抗原模拟表位,通过ELISA鉴定得到阳性克隆。再把得到的阳性克隆进行大管扩增,用扩增液分别与10例日本血吸虫病患者血清、10例健康者血清、Assp免疫兔血清2份进行ELISA反应,分析其免疫反应情况。 4.阳性克隆DNA序列的测定及其相应氨基酸序列的分析 经过ELISA鉴定具有免疫活性的阳性克隆进行扩增,提取单链DNA进行测序。利用SWISS-PROT蛋白质数据库,运用BLAST软件,将As抗原模拟表位在日本血吸虫和猪蛔虫蛋白质数据库中进行氨基酸序列相似性分析。 5. HRP标记Assp用于日本血吸虫抗体的检测 参照改良过碘酸钠法采用HRP标记Assp得到HRP-Assp,经Dot-ELISA观察HRP-Assp与Assp免疫兔血清反应,并测定效价;再将 HRP-Assp分别用于直接Dot-ELISA和间接Dot-ELISA检测10份日本血吸虫病患者血清(sera of patients with schistosomiasis japonica,Sj-S),并与检测10份健康人血清(sera of healthy persons,Hp-S)、8份卫氏并殖吸虫病患者(sera of patients with paragonimiasis,P-S)、10份囊尾蚴病患者血清(sera of patients with cysticercosis,C-S)和6份旋毛虫病患者血清(sera of patients with trichinelliasis,T-S)进行比较。 结果：1. As与SEA的蛋白组分分析 (1)SDS-PAGE结果 Assp-1、Assp-2与SEA之间至少存在4条蛋白分子量相似的蛋白条带,其对应的分子量为:146 kDa、69.5 kDa、63.3 kDa和51 kDa。Assp-1与Assp-2之间存在分子量为21~146 kDa的14条共同蛋白条带;Assp-1特有5条蛋白条带,相应的分子量为:41 kDa、36.7 kDa、33 kDa、24 kDa和15 kDa。SEA存在分子量为28~146 kDa的蛋白条带。 (2)Western blot结果 Assp-1、Assp-2和SEA与日本血吸虫病患者血清反应有4条较为清晰的共同蛋白条带,对应分子量为146 kDa、124.7 kDa、109 kDa和69.5 kDa。Assp-1、Assp-2和SEA分别与正常人血清均没有免疫反应出现。 Assp-1和Assp-2与日本血吸虫病患者血清反应有7条主条带,分子量在69.5~146 kDa。SEA被日本血吸虫病患者血清识别的条带为13条,对应分子量范围为28~146kDa,在69.5~98 kDa与34~48 kDa范围内蛋白带多而密集,显色融合成片,以124.7 kDa处条带最为清晰。 Assp-1、Assp-2与Assp免疫兔血清反应有12条较为清晰的相同条带,对应分子量在51~146 kDa;Assp-1特有3条反应较为清晰的条带,对应分子量为41 kDa、24 kDa和15 kDa;Assp-2特有1条反应较为清晰的条带,分子量为21 kDa。而SEA与Assp免疫兔血清反应没有条带出现。 2. As抗原模拟表位的筛选及氨基酸序列的分析结果 经过2轮的吸附-洗脱-扩增,获得了1个 A491nm值较高的阳性克隆,具有较好的敏感性与特异性。通过DNA测序,Blast软件分析其氨基酸序列,发现As抗原模拟表位与猪蛔虫的丙酮酸脱氢酶激酶有四个连续氨基酸(TRRL)是一致的,与日本血吸虫的副肌球蛋白也有四个连续氨基酸(LQIT)是一致的。 3. HRP标记Assp用于检测日本血吸虫抗体的结果 将HRP标记Assp得到具有较高效价的HRP-Assp。 (1)HRP-Assp用于直接Dot-ELISA检测Sj-S效果的测定结果 HRP-Assp用于直接Dot-ELISA与44份人血清反应,其中10份Sj-S均呈强阳性,阳性反应率为100％;10份Hp-S中2份呈弱阳性,阳性反应率为20%;8份P-S中2份呈弱阳性,阳性反应率为25%;10份C-S中3份呈弱阳性,阳性反应率为30%;6份T-S中3份呈弱阳性,阳性反应率为50%。 (2)HRP-Assp用于间接Dot-ELISA检测Sj-S效果的验证结果 每张分别包被日本血吸虫病患者混合血清和SEA的试纸条先分别与10份Hp-S、10份Sj-S、8份P-S、10份C-S和6份T-S反应,再与1:100的HRP-Assp反应。其中与Sj-S反应,阳性反应率为100%;与其余血清反应,阳性反应率为0%。 结论：1.HRP-Assp用于Dot-ELISA检测Sj-S中的抗日本血吸虫抗体具有良好的效果。 2.Assp-1、Assp-2和SEA之间存在4种具有免疫活性的共同蛋白组分,说明Assp中可能存在对日本血吸虫病有诊断价值的抗原。 3.As抗原模拟表位能与日本血吸虫病患者血清反应而不与正常人血清反应,进一步证实了As具有应用于血吸虫病诊断的潜在价值。 4.As抗原模拟表位在日本血吸虫和猪蛔虫蛋白质数据中均找到了相似氨基酸序列(TRRL和LQIT),但序列不同,可能因为日本血吸虫抗体识别As和SEA的抗原表位不同,更进一步说明As用于检测日本血吸虫抗体具有良好的应用前景。