DHBV分子流行病学调查及雏鸭人工感染DHBV疾病模型的建立与初步应用

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本研究根据GenBank中登录的鸭乙型肝炎病毒(Duck hepatitis B virus,DHBV)的全基因序列,建立了常规PCR和荧光定量PCR两种检测DHBV方法,分别用于DHBV分子流行病学调查和人工感染DHBV疾病模型的建立。并利用建立的疾病模型筛选和评估抗乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)新药物的研究。 针对DHBV的保守序列设计1对引物,建立了PCR检测方法,采用该方法检测含DHBV样品能够扩增出215bp预期大小的片段。该方法对鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭源致病性大肠埃希氏菌、鸭源致病性沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌等感染鸭的常见病原都呈阴性反应;检测DHBV核酸的灵敏度可达0.42pg,对天府肉鸭血清检测的阳性率为12.34%(38/326)。该法特异强、灵敏性高,可用于DHBV的快速诊断和分子流行病学调查。 针对DHBV的P基因上的保守序列设计并合成引物和荧光标记探针,建立了实时荧光定量聚合酶链反应(fluorsescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测方法。建立的标准曲线循环阈值(cycle threshold,Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.996,最低可检测5 copies/L的DHBV-DNA,即相当于5个DHBV颗粒。该方法较常规PCR技术更为简便、快速、准确,灵敏度高100倍。 用不同剂量的DHBV阳性血清经不同感染途径人工感染1日龄天府肉鸭(DHBV为阴性),于感染后2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d、16d、19d、22d、26d、31d、37d、44d、52d、60d、70d分别杀鸭无菌取血和肝组织,用所建立的FQ-PCR方法检测肝脏和外周血中DHBV-DNA的含量。结果感染后48h可从外周血和肝组织中检测出DHBV-DNA,到70天仍可检测出较高水平的DHBV-DNA;肝组织中DHBV-DNA含量的整体水平比外周血中高,维持时间也较长。外周血和肝组织中的DHBV-DNA水平与感染剂量呈正相关,并表现出一定的剂量依赖性。天府肉鸭对DHBV敏感,用DHBV阳性血清感染1日龄天府肉鸭可建立DHBV疾病感染模型。 用天府肉鸭DHBV感染模型研究新药PNA对DHBV的抑制作用,在用药前、用药后5天、用药后10天及停药后3天分别采血和肝组织,用FQ-PCR检测血清和肝组织中DHBV—DNA,并用拉米夫定作对照。给药5天、10天时血清和肝组织中DHBV—DNA总体水平显著下降(P<0.05),停药3天后DHBV-DNA含量较用药时有所回升。PNA给药组和拉米夫定对照组对DHBV-DNA的抑制率差异不显著(P>0.05)。即PNA能有效降低血
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