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目的胰腺癌为高度恶性的乏血管肿瘤，其组织中有高丰度的HIF-1α表达，而HIF-1α在肿瘤细胞缺氧自适应过程中对肿瘤细胞的糖代谢起着重要调节作用。因此，以HIF-1α为靶点有望成为治疗胰腺癌的有效手段。当前，RNAi技术可以高效、特异性地促使靶基因mRNA的降解，阻断靶基因的表达，达到基因敲除的效果。而作为基因治疗的载体——腺相关病毒（AAV），因其无致病性、无免疫原性、可感染分裂细胞和非分裂细胞等特点被认为是抗肿瘤基因治疗的最理想载体，而抗坏血酸具有促进HIF-1α蛋白降解的作用。因此，本实验将以重组腺相关病毒（rAAV）为载体介导以HIF-1α为靶点的siRNA，联合抗坏血酸，作用于MiaPaC2人胰腺癌细胞，厌氧培养条件下观察其对糖代谢反应关键酶——葡萄糖转运体-1（Glut-1）表达的影响，为进一步探讨基因联合药物治疗胰腺癌提供一些理论依据。方法1．提取和扩增载体质粒pAAV-hrGFP和pAAV-H1-siRNA-hrGFP及辅助质粒pAAV-RC、pAAV-Helper；应用磷酸钙沉淀三质粒共转染HEK293细胞法包装rAAV；提取和纯化rAAV并计算其滴度；再应用rAAV转染MiaPaCa2人胰腺癌细胞，利用GFP观察荧光表达判断转染效果。2．对于厌氧培养下（5％CO2、1％O2、94％N2）的MiaPaCa2人胰腺癌细胞，分5组并给予不同处理因素，（①空白对照组、②空载病毒组、③单纯抗坏血酸组、④单纯rAAV-H1-siRNA-hrGFP组、⑤rAAV-H1-siRNA-hrGFP联合抗坏血酸组），24和48小时后，应用蛋白印迹法观察对MiaPaCa2人胰腺癌细胞HIF-1α蛋白表达的影响，应用RT-PCR法和蛋白印迹法分别观察对MiaPaCa2人胰腺癌细胞Glut-1基因及蛋白表达的影响。结果1．成功包装了rAAV，其形态正常、纯度满意、滴度达4×1013particles／ml。将rAAV-HIF-1α-siRNA转染MiaPaC2人胰腺癌细胞，荧光显微镜下可见绿色荧光表达。2．Western Blot研究发现，rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate作用于MiaPaC2细胞24h后，与对照组比，HIF-1α蛋白明显下降；在联合组中，48h下降更为显著。应用RT-PCR法检测各不同处理因素对MiaPaC2人胰腺癌细胞Glut-1 mRNA表达，发现rAAV-HIF-1α-siRNA和抗坏血酸有抑制MiaPaC2人胰腺癌细胞Glut-1 mRNA表达的作用，与对照组相比，差异有显著性（P＜0.01），而rAAV-hrGFP对MiaPaC2细胞Glut-1 mRNA的表达无任何影响（P＞0.05），且rAAV-HIF-1α-siRNA抑制Glut-1 mRNA的表达在48小时到达高峰，明显超过其在24小时的作用：应用Western Blot检测发现，rAAV-H1-siRNA-hrGFP处理组、抗坏血酸处理组及rAAV-H1-siRNA-hrGFP联合抗坏血酸处理组的Glut-1蛋白的表达，与对照组相比，有显著性差异（P＜0.01）；而rAAV-hrGFP组与对照组相比，Glut-1蛋白的表达未见明显显著性差异（P＞0.05），且24小时Glut-1蛋白的表达便明显下降，48小时下降更加显著。结论1．成功包装rAAV，其形态、纯度及滴度满意，且能成功的转染MiaPaC2人胰腺癌细胞。2．rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate都可抑制MiaPaC2细胞HIF-1α蛋白表达，并且其联合作用大于其单独作。rAAV-H1-siRNA-hrGFP和抗坏血酸都有抑制MiaPaC2人胰腺癌细胞糖代谢关键酶Glut-1表达的作用，从而抑制肿瘤细胞的增殖，最终可能达到治疗胰腺癌的目的。