肿瘤是威胁人类健康的重大疾病,目前常用的临床治疗手段对肿瘤难以达到根治的目的,对恶性程度高的晚期肿瘤和多发性转移肿瘤则更加无能为力。肿瘤化疗使用的药物多具有强烈的细胞毒性,摄入后经血液循环分布于全身,抑制肿瘤细胞的同时也对正常细胞造成严重杀伤,导致难以耐受的全身毒性反应,甚至加速患者死亡。随着纳米技术的兴起和基础肿瘤研究的深入,纳米粒子选择性地分布并滞留于肿瘤组织中的现象引起了极大的关注,进一步的研究阐明其本质为纳米粒子与肿瘤组织中纳米尺度生物结构之间的相互作用,这一现象被命名为肿瘤组织的高通透性与滞留(enhanced permeability and retention,EPR)效应。在EPR效应的理论基础上,抗肿瘤纳米药物递送系统(nanoscale drug delivery system,NDDS)应运而生。NDDS能够将药物靶向递送至肿瘤组织内部,减少化疗药物的全身分布,增强药物的治疗效果并减小全身毒性。然而,近20年来的深入研究发现,NDDS在临床应用中的效果与EPR效应的理论预期还有巨大的差距,EPR效应的潜能还未被充分利用。进入体内后,NDDS的药物递送过程处于复杂的体液环境中,在各种内外部压力作用下,NDDS到达肿瘤组织前在体液循环中释放药物(premature drug release,PDR)难以避免,为减少PDR,NDDS必须具有稳定的结构和缓慢的释药性质。但在进入肿瘤组织或肿瘤细胞后,NDDS又必须快速释放内部药物,使游离药物达到有效浓度才能杀伤肿瘤细胞。这种药物释放的困境对NDDS提出了严峻挑战。研究目的:为了减少PDR并确保NDDS在肿瘤细胞内快速释放药物,充分利用EPR效应对肿瘤组织进行靶向,特异性杀伤肿瘤干细胞,建立新的高效抗肿瘤纳米药物递送平台,本研究使用具有天然活性的网格蛋白作为修饰材料,利用其自组装性质,在装载抗肿瘤干细胞药物盐霉素(salinomycin,SAL)的脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle,LN)表面进行组装,制成网格蛋白修饰的盐霉素脂质纳米颗粒(CMLN-SAL)药物递送系统,以同时实现减少PDR,提高NDDS细胞摄取和保证细胞内的快速药物释放。研究内容:(1)CMLN-SAL的制备和表征。使用薄膜-超声法制备LN-SAL纳米颗粒,利用超速离心的方法从大鼠肝脏细胞中提取完整的网格蛋白包被小泡,制备游离的网格蛋白。在模拟的细胞内环境中共同孵育网格蛋白和LN-SAL,使网格蛋白在LN-SAL表面进行组装,制成CMLN-SAL。建立NDDS的纯化方法,研究LN-SAL和CMLN-SAL的载药性质,分析CMLN-SAL的主要成分构成。表征LN-SAL和CMLN-SAL的水化粒径和表面电荷性质。(2)CMLN-SAL的形态和抗变形性研究。使用透射电子显微镜和原子力显微镜对LN-SAL和CMLN-SAL的形貌进行观察,测量粒径。分析通过不同方法测定的粒子粒径和高度值的差异,计算粒子的抗变形性。(3)CMLN-SAL的释药动力学研究。在平静血浆、超生震荡、细胞内环境和外部挤压等条件下考察LN-SAL和CMLN-SAL的药物释放性质。(4)CMLN-SAL的细胞摄取。使用碘化丙啶(PI)作为荧光探针,制备荧光标记的LN-PI和CMLN-PI。通过共聚焦显微镜和流式细胞技术考察LN-PI和CMLN-PI的细胞摄取效率。进一步使用细胞摄取通路抑制剂:氯丙嗪、制霉菌素、盐酸阿米洛利、莫能星和秋水仙碱研究两种纳米粒子的细胞摄取机制。(5)CMLN-SAL的肿瘤细胞抑制作用。利用荧光抗体标记肿瘤干细胞,流式细胞技术考察CMLN-SAL和LN-SAL对肝癌细胞系HepG2和Huh-7中肿瘤干细胞亚群的杀伤作用。研究CMLN-SAL和LN-SAL对体外培养的肝癌HepG2细胞系的生长抑制作用。通过流式细胞技术研究CMLN-SAL和LN-SAL对肿瘤细胞的凋亡诱导作用。研究结果:(1)成功建立SAL的浓度检测方法,SAL的线性方程为A=0.02457 C+0.01156(R~2=0.99802)。通过微量葡萄糖凝胶柱-离心法对LN-SAL和CMLN-SAL进行纯化,洗脱曲线表明,在前三次离心的洗脱液中,仅有2.2%的游离盐霉素和4.6%的游离蛋白,而LN-SAL和CMLN-SAL则能够全部收集,该方法能够充分分离纳米粒子和溶液中的游离原料。使用SDS-PAGE和western-blot的方法对CMLN-SAL的蛋白成分进行定性分析,证明其蛋白外壳的主要成分为网格蛋白。在充分纯化的基础上对LN-SAL和CMLN-SAL的载药性质和成分比例进行分析,LN-SAL的包封率和载药量分别为97.96±1.67%和12.81±0.19%。CMLN-SAL的包封率和载药量分别为93.50±1.93%和10.14±0.22%,其中蛋白和脂质材料分别占总量的17.58±0.3%和72.29±0.08%。动态光散射法测得LN-SAL和CMLN-SAL的水化粒径分别为198.83±1.07 nm和310.13±2.99 nm,Zeta电位分别为-33.53±1.52 mv和-36.63±0.23 mv。(2)使用透射电子显微镜观察CMLN-SAL的表面结构,从形态学上确定了网格蛋白包被的成功组装,LN-SAL和CMLN-SAL的电镜直径分别为123±16 nm和312±33 nm。原子力显微镜研究结果表明LN-SAL和CMLN-SAL的原子力显微高度分别为12±2 nm和31±3 nm,原子力显微直径分别为31±3 nm和231±54nm。进一步比较不同方法测定的粒子粒径之间的差异,计算两种纳米粒子的抗变形性,结果表明CMLN-SAL的抗变形性显著高于LN-SAL。(3)药物释放实验结果表明在平静血浆、超生震荡、和外部挤压等条件下,与LN-SAL相比CMLN-SAL具有更为缓慢的释药性质,差异具有统计学意义。在细胞内环境中,HSC70水解CMLN-SAL的网格蛋白外壳,显著提高其释药速率,达到LN-SAL水平。(4)对两种NDDS的细胞摄取进行定性和定量研究。结果表明,在相同时间内,与LN-PI相比,CMLN-PI处理组细胞的荧光强度更高,差异具有统计学意义。摄取机制研究的结果表明氯丙嗪对CMLN-PI摄取的抑制作用更强,在氯丙嗪处理的细胞中,CMLN-PI的摄取量下降38.1%,LN-PI的摄取量下降20.9%。秋水仙碱对LN-PI摄取的抑制作用更强,使LN-PI的摄取量下降27.9%,CMLN-PI的摄取量下降12%。说明CMLN-PI更依赖网格蛋白介导的内吞作用进入细胞,而LN-PI的细胞摄取更依赖于巨胞饮作用。(5)在LN-SAL、CMLN-SAL和SAL溶液三种SAL制剂中,CMLN-SAL对肿瘤干细胞和整体肿瘤细胞群的抑制作用最强,差异具有统计学意义。在体外诱导肿瘤细胞凋亡的实验中,CMLN-SAL处理组细胞的早期凋亡、晚期凋亡和死亡数量均显著高于LN-SAL和SAL溶液处理组。结果表明,与LN-SAL和SAL溶液相比,CMLN-SAL具有更强的肿瘤细胞杀伤作用。研究结论:使用网格蛋白作为修饰材料,制成了新型抗肿瘤纳米药物递送系统CMLN-SAL。CMLN-SAL的网格蛋白外壳使其具有更强的抗变形性,能够抵抗各种内外部压力的作用,减少药物在递送过程中的丢失。在细胞质中,CMLN-SAL的网格蛋白外壳被HSC70水解,获得快速释药的能力。同时,CMLN-SAL具有更高的细胞摄取效率,能够将更多的药物递送到肿瘤细胞内部,快速释放形成有效药物浓度,对肿瘤细胞造成更强的杀伤。综上所述,CMLN-SAL是一种高效的NDDS,解决了NDDS的释药难题,具有重要的科研价值和广阔的临床应用前景,本研究为CMLN-SAL的进一步开发和临床应用奠定了实验基础。