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墨兰和红掌具有极高的观赏价值和经济价值,市场前景十分广阔。研究农杆菌介导的墨兰和红掌的转基因技术对推动墨兰和红掌新品种培育具有重要意义。本研究以‘企剑白墨’的根状茎和红掌盆栽品种的叶片为材料,研究了外源激素以及各种抗生素对白墨根状茎增殖和分化的影响,基因型、基本培养基、外源激素以及各种抗生素对红掌愈伤组织增殖和分化的影响,预培养时间、乙酰丁香酮、工程菌液浓度、侵染时间、共培养时间对白墨遗传转化效率的影响,并对白墨和红掌进行了遗传转化,旨在优化墨兰和红掌的受体系统,建立根癌农杆菌介导的墨兰遗传转化技术体系,将功能基因转入红掌体内。主要研究结果如下:
1.墨兰
(1)外源激素对‘企剑白墨’根状茎的增殖及分化均有显著影响,蔗糖浓度对‘企剑白墨’的生根壮苗有显著影响。当6-BA为2.0mg·L-1、2,4-D为2.0mg·L-1时,根状茎的绝对生长速率最高;当6-BA为5.0mg·L-1、NAA为1.0mg·L-1时,根状茎的分化效果最佳;蔗糖为40mg·L-1时,生根壮苗效果最佳,平均每株有0.80条根,平均根长为2.07cm,平均苗高为3.89cm,3cm以上苗的分化率达到49.59%。
(2)头孢霉素和潮霉素对‘企剑白墨’根状茎的增殖及分化均有显著影响。当头孢霉素为300mg·L-1时,根状茎的绝对生长速率为112.20%,芽诱导率为64.44%、平均芽分化数为0.78个/根状茎,平均苗分化数为0.38棵/根状茎;当潮霉素为50mg·L-1时,根状茎的褐化率为30.56%,死亡率为59.72%。表明墨兰转基因时,抑制根癌农杆菌EHA105可采用的头孢霉素浓度为250mg·L-1;转化体筛选可采用的潮霉素浓度为50mg·L-1。
(3)根状茎的不同部位、预培养时间、乙酰丁香酮、工程菌液浓度、侵染时间、共培养时间均对白墨根状茎的瞬时转化效率有显著影响。当以幼嫩根状茎尖为材料,预培养38d,在工程菌液和共培养基中均添加200μmol·L-1AS,OD600为0.9,侵染37min,共培养7d时,‘企剑白墨’根状茎的GUS瞬时表达率最高,为11.67%。采用上述转化条件对‘企剑白墨’进行遗传转化,获得了3株含有GUS基因的墨兰苗,转化率为0.75%。
2.红掌
(1)基因型对叶片愈伤组织的诱导有显著影响,在含有1.0mg·L-16-BA、0.1mg·L-12,4-D的Nitsch培养基上,053-1叶片愈伤组织的诱导率最高,为81.25%;旭日次之,为60.42%;大哥大最低,为13.54%。当用大哥大无菌苗的叶柄诱导愈伤组织时,诱导率为94.79%。基本培养基对大哥大愈伤组织的增殖和芽分化有显著影响,对旭日愈伤组织的增殖有显著影响,对芽分化无显著影响。其中1/2MS培养基对大哥大和旭日的增殖效果最好,MS培养基对大哥大和旭日的芽诱导效果最好。
(2)头孢霉素、卡那霉素和潮霉素对红掌愈伤组织的生长有显著影响。当头孢霉素为250mg·L-1时,旭日和大哥大愈伤组织的绝对生长速率明显下降;当头孢霉素为500mg·L-1时,旭日和大哥大愈伤组织的芽分化数明显减少;当卡那霉素为300mg·L-1时,旭日愈伤组织的褐化率为18.06%,白化率为41.67%,每块愈伤组织的平均芽分化数为1.51个;当潮霉素为50mg·L-1时,大哥大愈伤组织的褐化率为47.92%,死亡率为28.13%,每块愈伤组织的平均芽分化数为0.68个。表明抑制含有固氮基因的农杆菌LBA4404生长的适宜头孢霉素浓度为500mg·L-1,抑制含有MAPKK基因的农杆菌LBA4404生长的适宜头孢霉素浓度为300mg·L-1;适宜旭日转化体筛选的卡那霉素浓度为300mg·L-1;适宜大哥大转化体筛选的潮霉素浓度为50mg·L-1。
(3)对分化出的芽进行了PCR检测,从3个样品DNA扩增出MAPKK基因的目的条带,遗传转化率为1.0%。