软骨缺损一直是外科修复治疗的难题,组织工程学能够结合细胞学和工程学原理对受损组织进行生理性修复,是一种理想的修复方法。由于其自身优势,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)被认为是目前软骨组织工程较理想的种子细胞,如何调控MSCs定向分化成软骨细胞是目前软骨组织工程学中的重要问题。然而,MSCs成软骨分化的精确分子调控机制还未完全阐明,因此探求MSCs成软骨分化的调控机制,有可能为探索切实有效的促分化策略提供基础,同时也有益于推进组织工程软骨在临床的应用前景。近年一些研究证实,microRNA(miRNAs)在干细胞的干性维持和分化中具有重要的功能。与越来越复杂的基因网络和蛋白网络相比,miRNAs表达特征谱作为一种新的强有力的工具,在组织器官的定向发育、细胞生长和分化的时空调节、信号通路的开启和关闭及疾病治疗靶点确定的研究中更具独特优势。探讨miRNAs在MSCs成软骨分化中的作用机制,将为进一步理解MSCs成软骨分化的调控网络提供新的视角。本课题拟从三个部分的实验研究对miRNAs介导的调控MSCs成软骨分化的生物学功能及分子机制进行系统的探讨。1.利用小鼠骨髓来源MSCs,建立稳定的体外诱导成软骨分化细胞模型。通过miRNA芯片技术获得小鼠MSCs成软骨分化不同阶段的miRNA表达谱,并以定量PCR实验对芯片结果进行验证。再结合生物信息学预测软件和定量PCR实验分析miRNA的靶基因,筛选出参与调控MSCs成软骨分化的候选靶基因。2.结合生物信息学实验和双荧光素酶报告基因检测,验证候选miRNA作用于预测靶基因结合位点的真实性。3.利用C3H10T1/2诱导成软骨分化细胞模型,检测针对候选miRNA的gain-of-function和loss-of-function干预实验中,各种软骨特异性标志表型的表达变化,证实候选miRNA调控MSCs成软骨分化的生物学效应。同时,以定量PCR和Western blot实验探索候选miRNA调节靶基因的作用机制。通过上述三部分实验,研究结果显示:1.通过直接贴壁法能够获得增殖能力强,MSCs标志CD分子表型一致,并具备多向分化能力(成骨分化、成脂分化和成软骨分化)的小鼠骨髓来源MSCs。基于此方法分离的MSCs,我们选取了MSCs成软骨分化不同阶段的细胞进行miRNA芯片扫描,包括:微团培养的P3 MSCs,MSCs诱导成软骨分化7d,MSCs诱导成软骨分化14d,单层培养的原代软骨细胞。结果在MSCs成软骨过程中,表达发生显著性改变的miRNAs有13个(8个上调,5个下调)。其中,miR-143/145和miR-132/212作为miRNA功能簇,在此进程中表达逐步下调。qPCR验证其中4个miRNAs的表达,与芯片结果一致,反映了芯片结果的可靠性。定量PCR结果显示,4个生物信息学预测差异表达的miRNAs的软骨相关靶基因在此进程中的表达模式与相应的miRNA表达模式呈相反趋势。提示这些差异表达的miRNAs可能参与调控MSCs成软骨分化。2.生物信息学预测,调控软骨形成的关键转录因子Sox9及其协同效应分子RelA分别是miR-145和miR-143的靶基因。为了验证其预测作用靶位点的真实性,我们分别成功构建了针对miR-145和miR-143的阳性对照荧光报告载体(pMIR-PT),包含预测靶位点的实验荧光报告载体(pMIR-MRE)和包含乱序排列的预测靶位点的实验荧光报告载体(pMIR-MUT)。双荧光素酶报告基因证实,miR-145能与Sox9的3’-UTR上预测靶位点有效结合,发挥抑制效应。结合miRNA芯片结果显示miR-145在诱导MSCs成软骨分化中的显著下调趋势,进一步提示miR-145有可能通过调节靶基因Sox9,参与调控MSCs成软骨分化进程。另一方面,miR-143的作用方式则不同于我们预期,我们仅得到了miR-143作用于RelA预测靶位点的阴性结果,其在MSCs成软骨分化中的作用有待于独立的实验再次探索。3.在C3H10T1/2诱导成软骨分化细胞模型中,miR-145过表达能抑制Sox9下游靶基因,同时也是软骨形成特征型表型基因(Col2a1、Agc1、COMP、Col9a2、Col11a1)的mRNA表达。相反,抑制miR-145表达则显著促进上述基因mRNA表达。同时, miR-145过表达能抑制细胞分泌软骨特征型细胞外基质GAGs。相反,抑制miR-145表达则显著提升GAGs形成。另外,miR-145仅在蛋白水平调节靶基因Sox9的表达。另一方面,无论过表达或抑制miR-145表达,均对Sox9下游非软骨形成相关特异性靶基因(C/EBPδ、C/EBPβ)的mRNA表达没有影响。进一步关于细胞增殖的实验结果发现,miR-145的改变并未对细胞增殖产生影响。研究结果证实miR-145调控MSCs成软骨分化的作用效应,其作用机制是以转录后水平调节Sox9表达,从而特异性参与调控MSCs成软骨分化。综上所述,本课题成功分离、培养小鼠骨髓来源MSCs,建立稳定的体外诱导MSCs成软骨分化的细胞模型。通过miRNA芯片技术首次获得小鼠MSCs成软骨分化4个不同阶段的miRNA表达谱,并经定量PCR验证了部分结果;筛选出与软骨形成相关候选miRNAs。验证了miR-145作用于Sox9的3’-UTR靶位点的真实性。同时也证实了RelA并非miR-143的靶基因。证实在TGF-β3驱动的MSCs成软骨分化中,miR-145表达下调能有效促进MSCs向软骨细胞系定向分化,其调控机制是通过转录后水平调节Sox9蛋白表达,从而以Sox9为重要介导因子,特异性参与调控MSCs成软骨分化进程。