目的:抗肿瘤药物引起的手足综合症表现为手掌-足底感觉迟钝及肢端红斑,是一种严重皮肤不良反应事件,主要发生在受压区域。因传统化疗药和小分子靶向药物引起手足综合症临床表型并不完全相同,临床将这两种毒性反应分别称为Hand-foot-syndrome(HFS)和 hand-foot-skin-reaction(HFSR)。目前关于这两类药物引起的手足综合症的发生机制研究很少。传统化疗药所引起的HFS以卡培他滨为甚,发生率可高达60%,严重影响了病人的生活质量。卡培他滨(Capecitabine)作为新一代口服嘧啶类药物,主要用于治疗晚期乳腺癌及结直肠癌,药效显著,临床上具有不可替代性。索拉菲尼(Sorafenib)作为分子靶向治疗药物,具有显著的抑制肿瘤作用,同时也是临床上唯一被批准的应用于晚期肝癌的一线用药,然而其引起手足综合症发生率可高达40%,极大的限制了 Sorafenib的临床应用价值。针对手足综合症,目前临床上并没有确切有效的治疗方案和保护措施。主要采用的是保守治疗方案,如减轻药物剂量,或采取终身停药的方式,但这些方式不利于肿瘤患者的治疗,危害肿瘤患者的生命。因此深入研究这两种药物引起手足综合症的发生机制具有重要的临床意义。本课题希望能针对其毒性发生机制展开研究,寻找两者的差异性,并基于此提出有效的保护手段和措施,借以解决临床问题,指导临床实践。方法:一、采用ICR小鼠模型模拟Capecitabine以及多激酶抑制剂Sorafenib在临床治疗剂量下所诱导小鼠爪部组织手足综合症,并探讨Capecitabine及多激酶抑制剂Sorafenib诱导小鼠手足综合症的病理差异。(1)采用ICR小鼠模型,采取灌胃给药的方式分别给予200mg/Kg Capecitabine,100mg/Kg Sorafenib,连续给药30天后处死小鼠,在给药期间每隔五天对小鼠爪部组织的进行图片采集。通过小鼠爪部组织形态学上的变化来考察Capecitabine以及多激酶抑制剂Sorafenib对小鼠爪部组织的影响。(2)在时间进程上考察了Capecitabine以及多激酶抑制剂Sorafenib引起手足综合症的发生率。(3)通过组织病理学HE考察对照组以及给药组Capecitabine组、Sorafenib组的小鼠爪部组织病理变化。二、采用角质形成细胞HaCaT、ICR动物模型,研究Capecitabine以及多激酶抑制剂Sorafenib引起手足综合症的发生机制。第一块内容通过组织基因芯片技术考察角化过程相关蛋白的变化。(1)通过组织基因芯片技术,检测角蛋白、角蛋白相关蛋白的变化情况。第二块内容研究Capecitbine引起手足综合症的发生机制。(1)采用S9孵育系统模拟药物在体内的代谢过程,考察Capecitabine对角质形成细胞的影响。(2)采用SRB考察Capecitabine对角质形成细胞的增殖抑制作用。(3)流式细胞术结合 Annexin V-FITC/Propidium iodide(PI)染色检测 Capecitabine对角质形成细胞的影响。(4)Western blotting法检测Capecitabine对角质形成细胞内凋亡相关蛋白的影响。(5)流式细胞术结合JC-1染色法检测Capecitabine对角质形成细胞的线粒体膜电位的影响。(6)Western blotting检测Capecitabine对角质形成细胞内线粒体损伤相关蛋白的影响。第三块内容研究Sorafenib引起手足综合症的发生机制。(1)通过免疫荧光技术考察多激酶抑制剂Sorafenib对小鼠爪部毛细血管的影响以及是否存在缺氧环境。(2)通过SRB考察缺氧环境下,多激酶抑制剂Sorafenib对角质形成细胞的增殖影响。(3)通过RT-PCR考察多激酶抑制剂Sorafenib对角质形成细胞角蛋白基因的影响。研究结果:1.Capecitabine以及多激酶抑制剂Sorafenib能模拟临床毒性,诱导小鼠发生手足综合症。在ICR小鼠模型上,采取灌胃给药的方式分别给予200mg/Kg Capecitabine,100mg/Kg Sorafenib连续给药30天后处死小鼠,在给药期间每隔五天对小鼠爪部组织的进行图片采集。随着给药时间的推移,发现对照组小鼠爪部组织并没有出现明显的组织形态学上的变化,而Capecitabine组在给药第五天时就出现了 一只小鼠发生了手足综合症,表现为小鼠爪部出现了红肿,并随着给药时间的延长,出现手足综合症的小鼠数量增多,最后都出现了手足综合症;多激酶抑制剂Sorafenib组随后也出现了手足综合症。通过组织病理学检测,发现在Capecitabine以及多激酶抑制剂Sorafenib两组造模组中,小鼠爪部组织都出现了肥大细胞浸润,属于早期炎症细胞的一种,能够招募粒细胞,并释放炎性因子,参与了炎症的发生。而临床上,在病人组织中也是出现了炎性细胞的浸润,表明模型构建基本符合。2.Capecitabine以及多激酶抑制剂 Sorafenib诱导小鼠手足综合症存在不同病理特征。通过组织病理学检测,发现相比于正常对照组Capecitabine造模组的小鼠爪部组织中出现角质层的减少,与临床结果一致;Sorafenib造模组,小鼠爪部组织出现角质层局部增厚,与临床角化过度特征一致。二者呈现出两种完全不同的病理特征。3.Capecitabine以及多激酶抑制剂Sorafenib对角化过程相关蛋白的影响。通过基因芯片数据分析发现在Capecitabine造模组中,角蛋白以及角蛋白相关蛋白出现了明显的下调;Sorafenib基因芯片分析结果显示角蛋白以及角蛋白相关蛋白都出现了上调。4.Capecitabine诱导手足综合症的发生机制是通过引起角质形成细胞发生线粒体损伤,从而诱导角质形成细胞发生凋亡,导致角质层减少,最终引起手足综合症的发生。通过S9孵育Capecitabine来模拟药物在体内的代谢过程,考察其对角质形成细胞的影响,结合SRB染色结果发现,Capecitabine对角质形成细胞具有杀伤作用。药物作用48小时后运用流式细胞术结合Annexin V-FITC/PropidiμM iodide(PI)、Western blotting考察,结果显示Capecitabine能够诱导角质形成细胞发生浓度依赖性的凋亡,凋亡相关蛋白Cleved-parp的表达也出现明显增加。JC-1染色结果显示,细胞线粒体膜电位出现明显的下调,以及线粒体相关蛋白Bcl-2、Bax也出现了相应的变化,表明Capecitabine引起角质形成细胞发生线粒体损伤所依赖的凋亡。5.多激酶抑制剂Sorafenib引起手足综合症的机制是其能破坏小鼠爪部组织的毛细血管,造成组织缺氧,促进了角质形成细胞的增殖,促进角蛋白的表达,促进角化过程,最终导致手足综合症的发生。免疫荧光检测CD31血管标记物以及低氧探针pimonidazole结果显示,多激酶抑制剂Sorafenib能够破坏小鼠爪部毛细血管,造成组织缺氧。SRB结果显示在缺氧环境Sorafenib能够引起角质形成细胞增殖。RT-PCR结果显示药物作用后Keratin 76、Keratin6b mRNA水平均出现了上调,表明角化过程加剧。结论:本课题揭示了 Capecitabine以及Sorafenib引起手足综合症的不同病理特征及发生机制,旨在为临床提供参考价值和指导意义,为后续研究提供新的思考方向。Capecitabine是通过诱导角质形成细胞发生线粒体损伤所介导的细胞凋亡,从而造成角质层减少,部分阐明卡培他滨引起HFS的诱发原因;多激酶抑制剂Sorafenib则是由于其靶点原因,破坏小鼠爪部组织的毛细血管,造成缺氧环境,而在缺氧环境下Sorafenib促进角质形成细胞的增殖,角蛋白的上调,促进角化过程,最终导致角质层增厚,这与临床报道索拉菲尼诱发的手足综合症多呈现角化过度的表型一致,为解释索拉菲尼诱发手足综合症原因提供实验数据。