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[目的]探讨滤泡淋巴瘤(Follicular lymphoma,FL)细胞分泌的外泌体携带miRNA在肿瘤免疫中的作用和分子机制,为FL的恶性转化的诊治和预防提供新的思路。[方法]第一部分:1.应用qRT-PCR检测11例FL不同阶段的病例中文献中挖掘的六种 miRNA(miR-30a,miR-31,miR-20c,miR-501,miR-199a,miR-7e-5p)的表达量。2.扩大样本量,利用qRT-PCR在14例FL,16例转化型滤泡淋巴瘤(tFL),16例弥漫大B淋巴瘤(DLBCL)临床样本中对miR-7e-5p表达量进行了检测。3.选取5例由FL进展为tFL的配对样本,进一步验证了 miR-7e-5p的表达量改变。4.在人类不同淋巴瘤细胞株(FL细胞株WSU-NHL,DoHH2,DLBCL细胞株OC1-LY3,SUDLH-8,TMD-8,Farage,套细胞淋巴瘤细胞株JeKol,伯基特淋巴瘤细胞株Daudi)中对miR-7e-5p表达量进行了检测。第二部分:1.利用siRNA技术,将si-c-MYC经脂质体瞬时转染入WSU-NHL细胞株中。24小时后,利用q-PCR检测细胞株其表达水平。2.检测了转染入si-c-MYC和未转染的WSU-NHL细胞株中miR-7e-5p的表达水平。3.通过Jaspar数据库,预测了 c-MYC与pri-miR-7e-5p启动子区域的结合位点。利用ChIP技术,对比非特异性结合位点,检测两者结合的DNA相对数量。4.取了 5例FL恶性转化的临床配对样本,对其进行了 c-MYC的免疫组化染色并对其打分,统计c-MYC阳性率与疾病进展的关系。第三部分:1.将Cy-3标记的miR-7e-5p mimics通过脂质体瞬时转染入小鼠淋巴瘤A20细胞株中,然后通过0.4微米孔径的Transwell小室(将A20细胞与小鼠原代巨噬细胞共培养。24小时后,在荧光显微镜下观察巨噬细胞内的Cy-3强度。2.利用聚合物沉淀法A20细胞上清液中分离出外泌体,并通过透射电镜和NTA对提取出的外泌体进行了形态学和纯度的鉴定。3.将miR-7e-5p mimics和inhibitors分别转染入A20细胞中,提取外泌体,并加入小鼠原代巨噬细胞培养液中共培养,利用q-PCR技术,对巨噬细胞内的miR-7e-5p表达量进行分析。第四部分:1.利用miRTarbase,miRBD以及TargatScan三大生物信息学数据库结合Panther数据库及GO分析,筛选miR-7e-5p的靶基因。2.我们将A20细胞经miR-7e-5p mimics和inhibitors处理后,与小鼠原代巨噬细胞共培养。利用WB,检测巨噬细胞内FasL以及Cleaved-PARP,PARP,Cleaved-Caspase8,Caspase8的表达量。3.A20细胞分别转染了不同浓度miR-7e-5p mimics和inhibitors,提取外泌体,加入小鼠原代巨噬细胞内共同培育利用q-PCR技术,检测了巨噬细胞内FasL的含量。4.将A20细胞做同上述实验相同处理,加入外泌体抑制剂-GW4869处理后,提取外泌体,加入小鼠原代巨噬细胞内共培养,利用流式细胞技术及Tunel染色,观察巨噬细胞的凋亡情况。5.将细胞经上述相同处理以后,利用WB,检测巨噬细胞内FasL,以及Cleaved-PARP,PARP,Cleaved-Caspase3,Caspase3 的表达量。[结果]第一部分:1.对比FL,这六种miRNA在DLBCL病例中表达量都有所下降,而miR-7e-5p在tFL和DLBCL病例中都有所下降。2.miR-7e-5p在FL及tFL中的表达量较DLBCL有所下降。3.miR-7e-5p的表达量随着疾病进展有了明显的下降。4.miR-7e-5p在FL细胞株中的表达量较DLBCL细胞株中有明显上升。第二部分:1.与空白对照组相比,转染了 si-c-MYC的细胞株,c-MYC的表达水平显著降低,证明了 siRNA的有效性。2.转染了 si-c-MYC的细胞株中miR-7e-5p的表达量较空白对照组明显降低。3.淋巴瘤细胞株中c-MYC能与pri-miR-7e-5p启动子直接结合,抑制其转录。4.当惰性滤泡淋巴瘤进展为转化型淋巴瘤时,c-MYC的阳性率明显上升。第三部分:1.miR-7e-5p可以通过非直接接触途径从A20细胞转入巨噬细胞内。2.通过聚合物沉淀法,提取的外泌体形态成茶杯托形状,其粒子直径约在100至150nm直径,其峰值约在130nm,浓度约2.4×10^8个/ml。其形态和直径浓度结果符合外泌体定义,证明此提取方法的有效性。3.miR-7e-5p能够通过外泌体从淋巴瘤细胞进入巨噬细胞中。第四部分:1.初步筛选出FasL为miR-7e-5p在淋巴瘤中的靶基因。2.巨噬细胞内的miR-7e-5p抑制了 FasL的表达,并抑制了巨噬细胞的凋亡。3.淋巴瘤细胞内miR-7e-5p表达量改变后,通过外泌体进入巨噬细胞,导致巨噬细胞内FasL表达量改变。4.miR-7e-5p能否通过外泌体对巨噬细胞内FasL产生影响从而抑制巨噬细胞凋亡。5.巨噬细胞内FasL改变,激活下游凋亡蛋白Caspase3和PARP,促进巨噬细胞凋亡。[结论]在滤泡淋巴瘤恶化转变过程中,c-MYC蛋白表达增加,抑制miR-7e-5p表达量,导致肿瘤细胞分泌的外泌体内携带的miR-7e-5p减少,进入巨噬细胞后,引起FasL表达量增加,通过激活下游Caspase3,PARP蛋白,促进巨噬细胞凋亡。