论文部分内容阅读
bHLH转录因子家族是继MYB家族之后的第二大植物转录因子家族。bHLH转录因子家族基因可参与植物的生长发育、各种信号途径的调控、逆境的响应、各种活性成分生物合成路径的调节。bHLH转录因子的亚家族PREs基因在模式植物拟南芥中参与细胞伸长、激素信号调控、光形态建成等生长发育的重要途径。然而我们对番茄中PREs基因在番茄中的功能研究却知之甚少。本研究是以番茄Lycopersicon esculentum Mill.var.Ailsa Craig(AC++)为研究材料,对PREs亚家族的SlPRE6-like基因进行了研究,主要研究内容及结果如下:(1)SlPRE6-like蛋白含有95个氨基酸序列。通过和其同源PREs氨基酸序列比对发现,该蛋白具有一个非典型的bHLH结构域。系统进化树分析可知,SlPRE6-like蛋白和拟南芥光形态建成蛋白AtPRE6有着很高的同源性。推测其可能参与光信号传导的调控。(2)SlPRE6-like基因在番茄AC++中的组织表达模式分析表明,该基因在幼嫩叶、成熟叶和花中表达量较高,尤其在幼嫩叶中表达丰度最高。在衰老叶、萼片和青果实中少量表达,在其它组织器官几乎不表达。表达模式分析表明SlPRE6-like基因可能参与番茄叶片的生长发育的调控。(3)植物叶片的发育与生物胁迫和非生物胁迫有着重要的关系。为此,我们对番茄AC++幼苗进行盐、高温、低温和干旱四种非生物胁迫处理。利用实时定量PCR检测SlPRE6-like基因在上述非生物胁迫中的表达情况,发现在盐(叶片)、高温处理情况下,其表达趋势迅速下调。而盐(根)、低温以及脱水胁迫时,SlPRE6-like表达趋势不明显。表明SlPRE6-like基因与盐(叶)和高温胁迫响应密切相关,而与盐(根)、低温以及脱水胁迫没有关系。(4)为研究植物叶片的发育与赤霉素和多效唑之间的关系,通过不同浓度赤霉素和多效唑处理野生型番茄,以10天幼苗为材料,经实时定量PCR分析,结果表明在不同浓度外源赤霉素处理下,相对于对照组,SlPRE6-like基因表达量都出现明显下调,而随着多效唑处理浓度的增加,SlPRE6-like基因表达量呈现先上升后下降的趋势。表明SlPRE6-like基因在调控番茄叶片生长发育过程中,可能与一定浓度的赤霉素和多效唑有关系。(5)通过前期生物信息学分析、表达模式分析、胁迫试验和外源赤霉素、多效唑的处理试验,发现SlPRE6-like基因极有可能参与番茄叶片的生长发育调控,为此,我们特构建了SlPRE6-like基因的超表达载体pBI121-SlPRE6-like,以期研究SlPRE6-like基因在番茄叶片中的具体生物学功能。采用农杆菌侵染转化野生型番茄子叶方法,成功筛选得到SlPRE6-like转基因阳性植株。在外观上,转基因番茄的叶片表现出明显向上卷曲,且植株容易死亡。在黑暗和光照条件处理下,转基因T1代10天大小幼苗的下胚轴长度均长于野生型,且叶绿素合成相关的基因DCL、SlGLK1在黑暗和光照的条件下,其表达量都出现显著的下调。通过比较两个月大小的转基因T1代幼苗番茄叶片和野生型番茄叶片,发现转基因番茄叶片出现明显的黄化和衰老。叶绿素合成相关基因SlGLK1出现显著的下调,DCL的表达量也有一定的下降,光合作用相关的基因SlCab7及SlRbcS、SlAUREA的表达量都出现下降,其中SlRbcS的下降尤为明显。表明SlPRE6-like基因可能参与叶绿素合成和光合作用相关的基因表达量调控,从而控制叶片的黄化和衰老。综上所述,本研究对番茄SlPRE6-like基因进行了生物信息学分析、胁迫处理及外源激素响应等试验的共同探索,发现番茄SlPRE6-like基因可能参与叶片发育调控,随后通过转基因功能验证系列相关试验表明SlPRE6-like基因对光照较为敏感,可能通过参与调节光合作用相关的主要基因的表达以及通过促进赤霉素信号的转导,进而调控番茄叶片卷曲、衰老。本研究对PREs家族基因SlPRE6-like在番茄中调控叶片卷曲、衰老进行了研究,为工程实践中对植物叶片的转基因改造奠定了基础,具有一定的市场价值。