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目的:研究抗菌肽LL-37/CRAMP增强乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力是否通过Wnt/β-catenin信号通路介导;LL-37/CRAMP能否诱导髓系巨噬细胞分化为M2型,并发挥促肿瘤作用。背景:目前乳腺癌是全世界最常见的女性恶性肿瘤,对女性健康的威胁不容置疑。抗菌肽LL-37普遍存在于人体各细胞和组织中,具有多种生物活性。LL-37除了具有抗菌活性外,还在机体内发挥抗感染、抗肿瘤、参与免疫调节、血管生成及损伤修复等多种效应。最新的研究发现LL-37对不同肿瘤的发生、发展具有不同的作用。癌症和肿瘤基因图谱（Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库分析显示原发性乳腺癌中LL-37的表达显著高于正常乳腺组织,这提示LL-37可能为乳腺癌的发生、发展提供了一定的生长优势。已有研究报道LL-37可活化PI3K/Akt信号途径诱导乳腺癌细胞系发生迁移,活化的Akt使包括GSK3β在内的多种底物磷酸化,从而抑制细胞凋亡并促进生存。而GSK3β作为丝氨酸/苏氨酸家族激酶成员之一,是Wnt信号系统中的关键组成成分,在β-catenin分子的调节中起着负性作用。但在乳腺癌中抗菌肽LL-37促进乳腺癌发生发展和Wnt/β-catenin信号通路之间是否存在关联尚未阐明。肿瘤微环境内存在着肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、树突状细胞（DCs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）、淋巴细胞等免疫细胞。肿瘤细胞能对肿瘤微环境进行改造,后者反过来又会影响肿瘤细胞的行为和状态。基于前期抗菌肽LL-37与Akt信号之间的联系,我们推测LL-37可能通过Wnt经典信号介导,促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学功能,并且影响肿瘤相关巨噬细胞趋向于M2型极化从而进一步发挥其促癌作用。方法:1、首先在人类癌症和肿瘤基因图谱（TCGA）数据库中进行搜索验证原发性乳腺癌和正常乳腺组织中LL-37的表达水平。体外实验中以MCF-10A（人正常乳腺上皮细胞系）作为对照,real-time PCR方法检测多种人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、BT549中抗菌肽CAMP基因的转录水平。通过外源性Cramp si RNA干扰小鼠乳腺癌细胞PY8119中抗菌肽的固有表达,real-time PCR检测对比分析干扰前后PY8119细胞中与增殖、迁移能力相关指标的转录水平变化,以初步探究抗菌肽LL-37/CRAMP对乳腺癌细胞生物学特征的作用。2、体外实验中以重组多肽LL-37/CRAMP处理人乳腺癌细胞系MCF-7和小鼠乳腺癌细胞系PY8119、4T1一定时间后,通过集落形成实验、CCK8、划痕愈合实验、Transwell检测乳腺癌细胞在增殖、侵袭、迁移能力的改变;收集乳腺癌细胞总RNA和总蛋白质,real-time PCR和Western Blot方法用于检测与细胞增殖、侵袭和迁移等细胞功能相关的指示标志物,信号通路（PI3K/Akt及Wnt/β-catenin）中的重要信号分子如β-catenin、GSK3β、AXIN2、LEF1、MMP-9的表达变化,以及乳腺癌细胞内部分相关受体如LRP5/6、FZD1、EGFR、FPR2、TLR4的激活程度;细胞免疫荧光共聚焦技术探究LL-37/CRAMP在处理乳腺癌后,β-catenin在细胞中的定位改变和p-β-catenin的表达强度变化,以明确Wnt/β-catenin信号通路受到抗菌肽作用后的激活情况;3、给予β-catenin特异性抑制剂XAV939处理乳腺癌细胞MCF-7和PY8119,以real-time PCR和Western Blot检测外源性重组多肽并抑制剂组中Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白包括p-β-catenin/β-catenin、p-GSK3β/GSK3β的表达水平变化;4、外源性重组多肽CRAMP预处理小鼠乳腺癌细胞系PY8119、4T1后,检测乳腺癌细胞-巨噬细胞共培养体系中巨噬细胞炎性因子CXCL1及M1、M2型巨噬细胞极化标志物（NOS2、ARG1）的表达,以验证LL-37/CRAMP是否有助于塑造促进乳腺癌发生发展的巨噬细胞免疫表型。结果:1、TCGA人类癌症数据库显示,原发性乳腺癌中抗菌肽LL-37的表达较正常组织显著上调。体外细胞实验中,与MCF-10A相比,MCF-7细胞CAMP基因的mRNA水平明显增加。当PY8119细胞的内源性Cramp表达沉默,增殖迁移能力相关指标c-myc、PCNA、MMP-9、fibronectin转录水平均下降,表明乳腺癌细胞增殖和迁移能力有所减弱。2、体外细胞实验结果发现,LL-37/CRAMP可显著提高MCF-7、PY8119细胞的增殖、横向和纵向迁移以及侵袭能力。定量分析显示LL-37/CRAMP明显促进细胞增殖和迁移标志物Cyclin D1、MMP-9的表达水平上升。3、给予外源性CRAMP后,PY8119细胞中Akt的mRNA水平明显高于未处理组,且Wnt通路响应基因,包括AXIN2、β-catenin、LEF1、fibronectin在PY8119细胞中呈时间依赖性方式显著上调。4T1、MCF-7乳腺癌细胞系中AXIN2、β-catenin、LEF1转录水平也均明显增加。经LL-37/CRAMP处理,发现PY8119、4T1、MCF-7三种细胞p-β-catenin/β-catenin信号蛋白表达降低,p-GSK3β/GSK3β上调。细胞免疫荧光染色实验亦观察到p-β-catenin绿色荧光明显减弱,β-catenin红色荧光与胞核蓝色荧光重叠后为粉红色,表明其部分易位至胞核中。此外,LL-37/CRAMP刺激下,PY8119细胞中Wnt信号通路受体LRP5/6、FZD1的mRNA水平升高,表明该信号通路受到明显激活。4、在MCF-7、PY8119细胞中,外源性重组多肽LL-37/CRAMP和Wnt/β-catenin特异性抑制剂XAV939处理组,p-β-catenin/β-catenin、p-GSK3β/GSK3β的蛋白表达水平与单纯LL-37/CRAMP处理组相比呈现出相反的变化趋势,即p-β-catenin/β-catenin信号蛋白表达升高,p-GSK3β/GSK3β下调。5、在乳腺癌细胞-巨噬细胞共培养体系中,经重组多肽CRAMP预处理后,PY8119、4T1细胞NOS2（M1型标志物）下调,ARG1（M2型标志物）表达上调,提示共培养环境中的巨噬细胞有向M2型极化的趋势。结论:本研究发现抗菌肽LL-37/CRAMP在乳腺癌中表达上调,经体外细胞实验证实LL-37/CRAMP通过激活Wnt经典信号传导显著增强乳腺癌细胞在增殖、侵袭和迁移方面的能力,并且促进巨噬细胞趋向于M2型极化,从而进一步发挥肿瘤促进作用。因此我们认为LL-37/CRAMP是促进乳腺癌发生发展的一种重要调节蛋白分子。这为抗菌肽类分子在乳腺癌进展过程中的作用机制提供新的发现,也提示了LL-37-Wnt/β-catenin可以作为乳腺癌临床诊断和治疗的候选靶点,为控制乳腺癌的发展转归提供了新的实验研究依据。