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近年来锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)技术、转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effect nucleases,TALEN)技术和成簇的规律性间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated,CRISPR/Cas)系统等基因编辑技术的发展为在生物体内和细胞中对基因组进行编辑和基因功能研究提供了简便高效的技术方法。CRISPR/Cas作为一种最新型基因编辑工具,可以高效地在内源环境中选择性的改变机体基因组DNA的功能,其为在生物学和医学等方面的研究提供了条件。本文利用该系统在HEK293细胞分别敲除Drosha基因和RNase L基因,以及在HeLa细胞的XRCC6(X-ray complementing defective repair in chinese hamster cells 6)基因C末端插入Flag标签,对上述三种基因分别进行了基因编辑并筛选获得稳定细胞系。本研究首先在HEK293细胞中对Drosha基因进行了敲除,利用基因敲入的方法,在Drosha基因的起始密码子处插入一段带有终止密码子的潮霉素抗性基因序列,破坏Drosha蛋白的编码框,从而使Drosha基因不表达,并且潮霉素B抗性基因序列的成功插入的细胞株获得潮霉素B抗性,从而提高了筛选效率。根据GenBank中Drosha基因序列,设计Drosha敲除的sgRNA序列,将其克隆到pCas-Guide真核表达载体中,获得pCas-sgRNA载体;设计供体DNA的同源臂序列,通过搭桥PCR将左同源臂、潮霉素B抗性基因和右同源臂扩增成为一条片段作为同源重组的修复模板,并将其克隆到pBackZero-T表达载体上,获得pBackZero-T-Drosha载体。将上述两个载体共转染HEK293细胞,用潮霉素B筛选,通过western blot和DNA测序等技术验证Drosha从基因组上敲除。本研究利用同样的方法在HEK293细胞中敲除了RNase L基因,获得5株RNase L完全敲除细胞株,并检测了敲除RNase L基因对HEK293细胞增殖、周期和凋亡的影响。除了敲除基因外,本研究使用CRISPR/Cas9技术进行了插入标签序列的基因编辑研究。在HeLa细胞中,在XRCC6基因C末端插入Flag标签序列。根据GenBank中XRCC6基因序列,设计XRCC6基因敲入的sgRNA序列,将sgRNA片段构建入pCas-Guide载体中,获得载体pCas-XRCC6;设计XRCC6基因的同源臂序列,利用搭桥PCR方法将同源臂和Flag标签序列作为模板进行扩增,得到donor DNA片段,并将该片段克隆到pBackZero-T载体上,获得pXRCC6-Donor载体。将上述两个载体共转染HeLa细胞,在蛋白水平上进行初步检测,根据western印迹结果,选择Flag标签序列插入效率最高HeLa细胞进行下一步稳定细胞株的筛选,从而减少工作量。然后再采用PCR、western印迹等方法筛选出Flag标签序列插入到XRCC6基因C末端的细胞株。获得表达XRCC6-Flag标签融合蛋白细胞系,为XRCC6与其它蛋白或RNA的相互作用和功能研究提供了细胞模型。本研究采用CRISPR/Cas9技术成功地对Drosha/XRCC6/RNase L基因分别进行了编辑,筛选获得了基因编辑的稳定细胞系,为深入开展基因功能研究提供了条件。