INPP5E基因在肌醇失衡状态下调控胚胎神经纤毛形成机制研究

来源 :北京工业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wangxiaoxiao880523
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神经管畸形(Neural tube defects,NTDs)是胚胎初期发育神经管闭合不全引起的严重的中枢神经系统先天畸形,其发病后果严重,导致胎儿发育早期死亡或出生后残疾,是中国儿童出生缺陷的重要问题。肌醇属于维生素B族营养物质,其代谢失衡与NTDs发生密切。INPP5E基因作为肌醇代谢通路关键基因,其缺失将影响神经纤毛发育,造成NTDs表型发生。本研究利用前期建立的肌醇代谢失衡NTD小鼠模型,采用免疫组化、蛋白免疫印迹、免疫荧光、扫描电子显微镜、ELISA试剂盒及功能基因PCR芯片等方法和技术,进一步检测肌醇代谢失衡状态中,INPP5E基因及纤毛发育相关基因在NTDs中的表达规律,探讨INPP5E基因在NTDs中发生的作用及分子机制。本研究选择对照(Control)组、肌醇干预表型正常(Non-NTD)组及神经管畸形表型(NTD)组的小鼠胚胎样本,体视显微镜下观察NTD组小鼠表型是否正常。免疫组化结果显示Non-NTD组及NTD组胚胎神经组织中INPP5E阳性细胞/阴性细胞比值均低于对照组(P<0.01),蛋白质免疫印迹结果显示NTD组及Non-NTD组中INPP5E蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.01),与免疫组化检测结果一致。为进一步验证INPP5E表达规律,使用NIH-3T3细胞系建立肌醇失衡细胞模型。通过蛋白质免疫印迹方法检测不同样本中INPP5E蛋白的表达水平,发现肌醇失衡(NTD)组细胞样本中INPP5E水平显著低于对照组(P<0.01)。提取细胞内脂质后,使用ELISA试剂盒检测NTD组和对照组细胞样本中肌醇代谢物PIP2水平,发现NTD组PIP2含量显著低于对照组(P<0.01)。免疫荧光实验显示肌醇失衡状态下,NIH-3T3细胞纤毛长度降低,纤毛数量减少。扫描电子显微镜观察结果显示,肌醇失衡组细胞纤毛数量低于对照组,纤毛长度低于对照组。筛选对照组、Non-NTD组及NTD组的小鼠胚胎神经组织样本用于PCR Assay基因芯片检测。NTD组与对照组比较,发现6个显著下调基因:Ift80,Kras,Mkks,Pkhd1,Prkca,Smo。Non-NTD与对照组相比,发现有10个基因显著下调:Ahi1,Mkks,Bbs7,Vangl2,Cep290,Kif3b,Kif3a,Pik3ca,Prkca,Tsc2,4个基因显著上调:Smo,Itgb1,B2m,Pdgfra。以上结果表明,肌醇代谢失衡状态下INPP5E基因表达降低,肌醇代谢物PIP2含量降低,同时影响初级纤毛稳定性,造成初级纤毛相关基因表达异常,进而引发NTDs。进一步探明肌醇代谢失衡条件下INPP5E基因在NTDs发生中的分子机制,为NTDs发病机理研究提供新的方向和思路。
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