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研究目的
对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是常用解热镇痛药，服用过量可引起严重的急性肝损伤(acute liver injury，ALI)，最终诱发急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)。APAP中毒是当前ALF病例的最常见诱因，也是社会关注的公共健康问题。关于APAP肝毒性的研究指出线粒体是其毒作用的关键靶标。线粒体损伤不仅影响ATP的生成，还能干扰线粒体分裂-融合机制的动态平衡，以及激活炎性小体介导的炎症反应，进一步加重肝脏损伤。课题组前期研究发现APAP染毒小鼠肝脏线粒体分裂-融合动态相关指标发生改变。线粒体分裂调控水平明显升高，线粒体融合蛋白表达减少，同时线粒体动态调控蛋白发生明显降解。前期研究结果提示线粒体动力学变化可能参与了APAP肝毒性的发生发展过程。因此，在本研究中我们选择APAP染毒C57/BL6雄性小鼠建立APAP肝损伤动物模型，分别利用线粒体分裂抑制剂Mdivi-1和蛋白酶体抑制剂MG-132干预线粒体分裂机制和线粒体动态调节蛋白的降解，以观察对APAP诱导小鼠急性肝损伤的保护效应。
研究方法
1.动物模型的建立
(1)线粒体分裂抑制剂1(Mitochondrial division inhibitor 1，Mdivi-1)干预模型:对照组、Mdivi-1对照组、APAP组、APAP+Mdivi-1组，每组10只小鼠(雄性C57BL/6)。统一禁食12h，对照组经腹腔注射给与生理盐水，Mdivi-1对照组经腹腔注射给与50mg/kg.bwMdivi-1，APAP组经腹腔注射给与300mg/kg.bwAPAP，Mdivi-1干预组提前30min以50mg/kg.bw剂量腹腔注射Mdivi-1后，再给予300mg/kg.bwAPAP。染毒24h后取血与肝脏组织。
(2)蛋白酶体抑制剂MG-132干预模型:对照组、MG-132对照组、APAP组、APAP+MG-132组，每组10只(雄性C57BL/6)。统一禁食12h，采取腹腔注射分别给与对照组与MG-132对照组生理盐水和3mg/kg.bwMG-132，APAP组经腹腔注射300mg/kg.bwAPAP，MG-132干预组提前30min以3mg/kg.bw剂量腹腔注射MG-132后，再给予300mg/kg.bwAPAP。24h后，摘眼球取血离心血清并摘取肝脏组织。
2.血生化指标和肝脏病理检测
(1)取血清，利用全自动生化分析仪检测ALT、AST指标的变化。
(2)摘肝脏称重，计算肝脏系数。利用小鼠肝脏组织制备石蜡切片，HE染色，观察APAP诱导小鼠急性肝损伤的病理变化。
3.透射电镜观察肝组织中线粒体分裂-融合过程的变化
取相同部位肝脏组织1mm3，迅速放入预冷的3％戊二醛中固定2h，再固定于1％OsO41h，梯度乙醇脱水后包埋在Epon812树脂中。使用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对超薄切片双重染色，并使用JEOL-1200EX透射电子显微镜观察，评价APAP染毒动物肝组织线粒体损伤和线粒体分裂-融合过程的变化。
4.线粒体分裂-融合机制和炎症相关分子的检测
(1)Mdivi-1干预模型小鼠，匀浆肝脏组织，提取总蛋白、线粒体蛋白及线粒体相关内质网膜(MAMs)蛋白组份，利用WesternBlot技术检测线粒体动态相关蛋白、线粒体自噬相关蛋白、内质网应激相关蛋白及炎症相关蛋白的表达变化。
(2)MG-132干预模型小鼠，匀浆肝脏组织，提取总蛋白和线粒体蛋白，利用WesternBlot技术检测线粒体动态相关蛋白及炎症相关蛋白的表达变化。
(3)肝脏免疫荧光检测。常规制备肝脏组织石蜡切片，脱蜡至水，浸入柠檬酸盐缓冲液中，通过微波炉加热进行抗原修复。将切片依次用0.3％TritonⅩ-100室温透膜10min，5％BSA室温封闭30min，然后与一抗过夜孵育。次日，荧光二抗与切片在室温下避光孵育1h。Hoechst33343染色细胞核，并用SlowFadeAntifadeMountant进行封片。荧光显微镜进行观察，进一步评价APAP处理肝组织关键蛋白的表达及线粒体分裂蛋白Drp1从细胞质移位至线粒体水平变化。
5.免疫共沉淀检测线粒体动态调控蛋白的泛素化
制备肝脏组织裂解液，每1000μg总蛋白的组织裂解液加入1-5μg目的蛋白一抗，4℃轻柔混合过夜。加入ProteinA和ProteinGbreads获得免疫复合物沉淀，WashBuffer清洗后通过WesternBlot进行分析，检测线粒体动态调控蛋白的泛素化变化。
研究结果
1.线粒体分裂干预剂对APAP诱导的小鼠肝脏线粒体损伤、内质网应激和炎症反应的影响
(1)Mdivi-1干预减轻APAP诱导的急性肝损伤。APAP染毒小鼠动物模型中，可观察到明显的肝损伤，表现为肝细胞坏死、炎性细胞浸润等组织病理改变，ALT、AST血生化水平显著升高。Mdivi-1预处理可显著降低APAP染毒小鼠血ALT和AST水平，改善APAP诱导的急性肝损伤。
(2)Mdivi-1干预对线粒体动态相关蛋白及线粒体损伤的影响。WesternBlot检测结果显示，APAP诱导肝损伤小鼠的Drp1和磷酸化Drp1(ser616)蛋白水平明显升高，提示线粒体分裂增加。Mdivi-1干预后，Drp1和磷酸化Drp1(ser616)的表达显著降低，免疫荧光检测结果与此相一致。同时，与对照组相比，APAP染毒小鼠肝脏中线粒体融合蛋白Mfn2和OPA1水平降低，而Mdivi-1预处理可明显抑制Mfn2和OPA1蛋白表达的下降。此外，透射电镜检测观察到APAP处理后线粒体出现损伤，表现为线粒体过度分裂，呈片段化形态。结果提示APAP处理后线粒体分裂增加，线粒体融合减弱。而Mdivi-1干预明显改善了线粒体动态失衡和线粒体损伤。
(3)Mdivi-1干预对线粒体自噬相关蛋白的影响。WesternBlot检测结果显示，APAP肝损伤模型组小鼠肝脏组织总蛋白和线粒体提取组分中LC3、p62、p-p62、PINK1、Parkin等线粒体自噬相关蛋白的水平均显著升高，且透射电镜观察到肝脏自噬体数量明显增多。而Mdivi-1干预组与模型组相比，肝脏组织总蛋白和线粒体提取组份中的LC3、p62、p-p62、PINK1、Parkin蛋白表达均明显降低。
(4)Mdivi-1干预对内质网应激相关蛋白的影响。WesternBlot结果发现APAP模型组小鼠肝脏组织中内质网应激相关蛋白CHOP、BIP的表达水平显著升高。与模型组相比，Mdivi-1干预后的CHOP、BIP表达显著下降。
(5)Mdivi-1干预对炎症相关蛋白的影响。WesternBlot结果发现APAP模型组小鼠肝脏组织中炎症相关蛋白NLRP3、caspase1、IL-1β的表达水平显著升高，提示APAP染毒引起NLRP3炎性小体信号通路激活。与模型组相比，Mdivi-1干预后NLRP3、caspase1、IL-1β的表达明显降低。
2.蛋白酶体抑制剂对APAP诱导的小鼠肝脏线粒体动态相关蛋白和炎症反应的影响
(1)MG-132显著保护了APAP诱导急性肝损伤。小鼠动物模型中，APAP给药24h后观察到明显的肝损伤，表现为肝细胞坏死、炎性细胞浸润等组织病理改变，ALT、AST血生化水平显著升高。MG-132预处理可显著降低血生化水平，改善APAP诱导的急性肝损伤。
(2)MG-132干预对线粒体动态相关蛋白的影响。与APAP模型组小鼠相比，MG-132预处理组Mfn2表达明显升高，Drp1表达显著减少，且Mfn2与Drp1裂解水平明显降低，结果提示MG-132抑制了线粒体动力学调控蛋白的裂解，促进线粒体分裂-融合动力学趋向平衡。
(3)MG-132干预对炎症相关蛋白的影响。与APAP模型组相比，MG-132预处理后炎症相关蛋白NLRP3、caspase1、IL-1β的表达水平显著降低，且活化的caspase1与成熟形式的IL-1β的水平在MG-132干预后也显著降低。提示MG132干预抑制了APAP诱导的NLRP3炎性小体的活化。
结论
1.过量APAP引起小鼠急性肝损伤，导致线粒体分裂-融合动态失衡，激活线粒体自噬、内质网应激及NLRP3炎性小体介导的炎症反应。
2.线粒体分裂抑制剂Mdivi-1能抑制APAP诱导的线粒体过度分裂，促进融合-裂变的平衡，进而抑制了线粒体自噬、内质网应激和NLRP3炎性小体的激活，保护APAP诱导的急性肝损伤。
3.蛋白酶体抑制剂MG-132能抑制线粒体动态调控蛋白的降解，维持线粒体质量控制，抑制NLRP3炎性小体的激活，保护APAP诱导的急性肝损伤。
对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是常用解热镇痛药，服用过量可引起严重的急性肝损伤(acute liver injury，ALI)，最终诱发急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)。APAP中毒是当前ALF病例的最常见诱因，也是社会关注的公共健康问题。关于APAP肝毒性的研究指出线粒体是其毒作用的关键靶标。线粒体损伤不仅影响ATP的生成，还能干扰线粒体分裂-融合机制的动态平衡，以及激活炎性小体介导的炎症反应，进一步加重肝脏损伤。课题组前期研究发现APAP染毒小鼠肝脏线粒体分裂-融合动态相关指标发生改变。线粒体分裂调控水平明显升高，线粒体融合蛋白表达减少，同时线粒体动态调控蛋白发生明显降解。前期研究结果提示线粒体动力学变化可能参与了APAP肝毒性的发生发展过程。因此，在本研究中我们选择APAP染毒C57/BL6雄性小鼠建立APAP肝损伤动物模型，分别利用线粒体分裂抑制剂Mdivi-1和蛋白酶体抑制剂MG-132干预线粒体分裂机制和线粒体动态调节蛋白的降解，以观察对APAP诱导小鼠急性肝损伤的保护效应。
研究方法
1.动物模型的建立
(1)线粒体分裂抑制剂1(Mitochondrial division inhibitor 1，Mdivi-1)干预模型:对照组、Mdivi-1对照组、APAP组、APAP+Mdivi-1组，每组10只小鼠(雄性C57BL/6)。统一禁食12h，对照组经腹腔注射给与生理盐水，Mdivi-1对照组经腹腔注射给与50mg/kg.bwMdivi-1，APAP组经腹腔注射给与300mg/kg.bwAPAP，Mdivi-1干预组提前30min以50mg/kg.bw剂量腹腔注射Mdivi-1后，再给予300mg/kg.bwAPAP。染毒24h后取血与肝脏组织。
(2)蛋白酶体抑制剂MG-132干预模型:对照组、MG-132对照组、APAP组、APAP+MG-132组，每组10只(雄性C57BL/6)。统一禁食12h，采取腹腔注射分别给与对照组与MG-132对照组生理盐水和3mg/kg.bwMG-132，APAP组经腹腔注射300mg/kg.bwAPAP，MG-132干预组提前30min以3mg/kg.bw剂量腹腔注射MG-132后，再给予300mg/kg.bwAPAP。24h后，摘眼球取血离心血清并摘取肝脏组织。
2.血生化指标和肝脏病理检测
(1)取血清，利用全自动生化分析仪检测ALT、AST指标的变化。
(2)摘肝脏称重，计算肝脏系数。利用小鼠肝脏组织制备石蜡切片，HE染色，观察APAP诱导小鼠急性肝损伤的病理变化。
3.透射电镜观察肝组织中线粒体分裂-融合过程的变化
取相同部位肝脏组织1mm3，迅速放入预冷的3％戊二醛中固定2h，再固定于1％OsO41h，梯度乙醇脱水后包埋在Epon812树脂中。使用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对超薄切片双重染色，并使用JEOL-1200EX透射电子显微镜观察，评价APAP染毒动物肝组织线粒体损伤和线粒体分裂-融合过程的变化。
4.线粒体分裂-融合机制和炎症相关分子的检测
(1)Mdivi-1干预模型小鼠，匀浆肝脏组织，提取总蛋白、线粒体蛋白及线粒体相关内质网膜(MAMs)蛋白组份，利用WesternBlot技术检测线粒体动态相关蛋白、线粒体自噬相关蛋白、内质网应激相关蛋白及炎症相关蛋白的表达变化。
(2)MG-132干预模型小鼠，匀浆肝脏组织，提取总蛋白和线粒体蛋白，利用WesternBlot技术检测线粒体动态相关蛋白及炎症相关蛋白的表达变化。
(3)肝脏免疫荧光检测。常规制备肝脏组织石蜡切片，脱蜡至水，浸入柠檬酸盐缓冲液中，通过微波炉加热进行抗原修复。将切片依次用0.3％TritonⅩ-100室温透膜10min，5％BSA室温封闭30min，然后与一抗过夜孵育。次日，荧光二抗与切片在室温下避光孵育1h。Hoechst33343染色细胞核，并用SlowFadeAntifadeMountant进行封片。荧光显微镜进行观察，进一步评价APAP处理肝组织关键蛋白的表达及线粒体分裂蛋白Drp1从细胞质移位至线粒体水平变化。
5.免疫共沉淀检测线粒体动态调控蛋白的泛素化
制备肝脏组织裂解液，每1000μg总蛋白的组织裂解液加入1-5μg目的蛋白一抗，4℃轻柔混合过夜。加入ProteinA和ProteinGbreads获得免疫复合物沉淀，WashBuffer清洗后通过WesternBlot进行分析，检测线粒体动态调控蛋白的泛素化变化。
研究结果
1.线粒体分裂干预剂对APAP诱导的小鼠肝脏线粒体损伤、内质网应激和炎症反应的影响
(1)Mdivi-1干预减轻APAP诱导的急性肝损伤。APAP染毒小鼠动物模型中，可观察到明显的肝损伤，表现为肝细胞坏死、炎性细胞浸润等组织病理改变，ALT、AST血生化水平显著升高。Mdivi-1预处理可显著降低APAP染毒小鼠血ALT和AST水平，改善APAP诱导的急性肝损伤。
(2)Mdivi-1干预对线粒体动态相关蛋白及线粒体损伤的影响。WesternBlot检测结果显示，APAP诱导肝损伤小鼠的Drp1和磷酸化Drp1(ser616)蛋白水平明显升高，提示线粒体分裂增加。Mdivi-1干预后，Drp1和磷酸化Drp1(ser616)的表达显著降低，免疫荧光检测结果与此相一致。同时，与对照组相比，APAP染毒小鼠肝脏中线粒体融合蛋白Mfn2和OPA1水平降低，而Mdivi-1预处理可明显抑制Mfn2和OPA1蛋白表达的下降。此外，透射电镜检测观察到APAP处理后线粒体出现损伤，表现为线粒体过度分裂，呈片段化形态。结果提示APAP处理后线粒体分裂增加，线粒体融合减弱。而Mdivi-1干预明显改善了线粒体动态失衡和线粒体损伤。
(3)Mdivi-1干预对线粒体自噬相关蛋白的影响。WesternBlot检测结果显示，APAP肝损伤模型组小鼠肝脏组织总蛋白和线粒体提取组分中LC3、p62、p-p62、PINK1、Parkin等线粒体自噬相关蛋白的水平均显著升高，且透射电镜观察到肝脏自噬体数量明显增多。而Mdivi-1干预组与模型组相比，肝脏组织总蛋白和线粒体提取组份中的LC3、p62、p-p62、PINK1、Parkin蛋白表达均明显降低。
(4)Mdivi-1干预对内质网应激相关蛋白的影响。WesternBlot结果发现APAP模型组小鼠肝脏组织中内质网应激相关蛋白CHOP、BIP的表达水平显著升高。与模型组相比，Mdivi-1干预后的CHOP、BIP表达显著下降。
(5)Mdivi-1干预对炎症相关蛋白的影响。WesternBlot结果发现APAP模型组小鼠肝脏组织中炎症相关蛋白NLRP3、caspase1、IL-1β的表达水平显著升高，提示APAP染毒引起NLRP3炎性小体信号通路激活。与模型组相比，Mdivi-1干预后NLRP3、caspase1、IL-1β的表达明显降低。
2.蛋白酶体抑制剂对APAP诱导的小鼠肝脏线粒体动态相关蛋白和炎症反应的影响
(1)MG-132显著保护了APAP诱导急性肝损伤。小鼠动物模型中，APAP给药24h后观察到明显的肝损伤，表现为肝细胞坏死、炎性细胞浸润等组织病理改变，ALT、AST血生化水平显著升高。MG-132预处理可显著降低血生化水平，改善APAP诱导的急性肝损伤。
(2)MG-132干预对线粒体动态相关蛋白的影响。与APAP模型组小鼠相比，MG-132预处理组Mfn2表达明显升高，Drp1表达显著减少，且Mfn2与Drp1裂解水平明显降低，结果提示MG-132抑制了线粒体动力学调控蛋白的裂解，促进线粒体分裂-融合动力学趋向平衡。
(3)MG-132干预对炎症相关蛋白的影响。与APAP模型组相比，MG-132预处理后炎症相关蛋白NLRP3、caspase1、IL-1β的表达水平显著降低，且活化的caspase1与成熟形式的IL-1β的水平在MG-132干预后也显著降低。提示MG132干预抑制了APAP诱导的NLRP3炎性小体的活化。
结论
1.过量APAP引起小鼠急性肝损伤，导致线粒体分裂-融合动态失衡，激活线粒体自噬、内质网应激及NLRP3炎性小体介导的炎症反应。
2.线粒体分裂抑制剂Mdivi-1能抑制APAP诱导的线粒体过度分裂，促进融合-裂变的平衡，进而抑制了线粒体自噬、内质网应激和NLRP3炎性小体的激活，保护APAP诱导的急性肝损伤。
3.蛋白酶体抑制剂MG-132能抑制线粒体动态调控蛋白的降解，维持线粒体质量控制，抑制NLRP3炎性小体的激活，保护APAP诱导的急性肝损伤。