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研究背景:口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinoma,OSCC）是口腔颌面部最常见的上皮性恶性肿瘤,约占口腔恶性肿瘤的90%,常向区域淋巴结转移,晚期发生远处转移,肺是OSCC远处转移时常见的靶器官。癌相关成纤维细胞（Carcinoma-associated fibroblasts,CAFs）是肿瘤微环境中最重要的间质细胞之一,在肿瘤转移的调控中起作用。现有的研究已经证实,肿瘤来源的产物可以调控转移,包括肿瘤分泌的各种分子以及肿瘤来源的细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）等。EVs作为介导细胞间通讯的载体,同时也可以介导原发肿瘤和远处器官之间的信息交流。它是由细胞分泌的具有脂质双分子层结构小囊泡的总称,其中外泌体是源于内体途径的EVs,由于目前多采用差速联合超高速离心的方法来分离EVs,这种方法很难追溯EVs的亚细胞起源,因此国际细胞外囊泡协会将直径小于200 nm的EVs称为小EVs（small EVs,sEVs）。目前已有研究报道CAFs来源的sEVs在肿瘤发生发展中起到重要作用,但CAFs来源的sEVs如何促进预转移器官发生改变及其分子机制尚不十分清楚。研究目的:本研究目的为明确OSCC源性CAFs分泌的sEVs对肺的影响及其分子机制,探索逆转肺损伤的方法。材料方法:我们从临床上收集两例OSCC患者手术切除的原位肿瘤,用胰酶联合I型胶原酶消化法分离提取2株原代CAFs,分别命名为CAF-S1和CAF-S2。肿瘤细胞采用UM-SCC6细胞系。培养细胞并收集细胞72小时含去除sEVs血清的条件培养液,通过差速联合超高速离心的方法从细胞条件培养液中提取sEVs。通过C57BL/6J小鼠尾静脉注射不同细胞来源的sEVs,在实验周期的第3、7和14天处死取肺组织并将其固定、包埋、切片,通过苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining,HE）染色的方法以及Ashcroft评分考察OSCC来源的CAF sEVs在体内促肺纤维化情况,通过免疫荧光染色确定LOX在肺中的表达。通过C57BL/6J小鼠尾静脉注射两株CAF sEVs并腹腔注射LOX抑制剂β-氨基丙腈（β-aminopropionitrile,BAPN）,实验周期的第14天收集肺组织,通过HE染色及免疫荧光染色考察肺组织纤维化程度的变化以及LOX在肺组织中的表达情况。利用免疫荧光染色的方法来确定CAF sEVs在肺组织的靶细胞。小鼠肺成纤维细胞（Lung Fibroblast,LF）为从健康C57BL/6J小鼠肺组织中提取的原代细胞。利用肿瘤细胞黏附实验进一步考察CAFs sEVs作用LF后对肿瘤细胞黏附的影响。实验结果:CAF-S1、CAF-S2免疫荧光染色结果显示,广谱角蛋白CK呈阴性,说明CAF-S1和CAF-S2是非上皮来源的细胞,波形蛋白Vimentin和成纤维细胞活化蛋白FSP-1呈阳性,说明CAF-S1和CAF-S2是间质细胞,平滑肌肌动蛋白α-SMA和成纤维细胞活化蛋白FAP均呈阳性,说明提取到的CAF-S1和CAF-S2均表达典型的CAF细胞生物学标志物。收集CAF-S1和CAF-S2的去除血清中sEVs的条件培养液,并通过差速联合超高速离心的方法从中提取sEVs,通过蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）检测发现sEVs表达CD9和CD63,CD81和HSP70,不表达Calnexin,透射电镜检测结果显示sEVs呈典型的茶杯形。纳米颗粒追踪技术NTA检测结果发现,三种细胞分泌的sEVs粒径大小均在66nm左右。说明我们提取到的sEVs符合国际细胞外囊泡协会提出的鉴定标准。取C57BL/6J小鼠分为四个实验组,分别尾静脉注射PBS、UM-SCC6-sEVs、CAF-S1-sEVs和CAF-S2-sEVs,注射PBS的小鼠作为Control组。在实验周期的3、7、14天时处死。取小鼠肺组织切片进行了HE染色,通过Ashcroft评分考察了其肺纤维化的程度,结果发现注射3天后两组CAF-sEVs组的小鼠肺组织纤维化程度显著高于Control组（*p<0.05,**p<0.01）,而UM-SCC6-sEVs组与Control组没有明显差异（p>0.05）;注射7天后,CAF sEVs组的纤维化程度高于Control组（*p<0.05）,且高于UM-SCC6-sEVs组（*p<0.05）,而UM-SCC6-sEVs组与Control组没有明显差异（p>0.05）;注射14天后,CAF-sEVs组肺组织的纤维化程度显著高于Control组,且高于UM-SCC6-sEVs组（*p<0.05,***p<0.001）,UM-SCC6-sEVs组的肺组织纤维化程度高于Control组（*p<0.05）。这些结果提示我们OSCC细胞和CAFs来源的sEVs均具有促进肺纤维化的能力,但是CAF来源的sEVs促进肺组织纤维化的能力高于OSCC来源的sEVs。免疫荧光染色结果显示,注射14天后,CAF-sEVs组的小鼠肺组织LOX表达高于Control组且高于UM-SCC6-sEVs组（*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001）,而UM-SCC6-sEVs组小鼠肺组织中LOX的表达也高于Control组（*p<0.05）,这一结果提示,LOX在sEVs促进肺组织纤维化中可能起到作用。为了探究抑制CAF sEVs促OSCC肺纤维化的方法,取相同周龄的C57BL/6J鼠并注射相同量的CAF sEVs,同时腹腔注射LOX的抑制剂BAPN。结果显示,实验两周后,小鼠肺组织的LOX表达明显下降,而且肺纤维程度也降低,提示LOX是CAF sEVs促肺纤维化的关键因子,这一促进作用可以被BAPN抑制。将CAF sEVs用绿色荧光染料标记后通过尾静脉注射到C57BL/6J小鼠体内,24h后取肺组织进行免疫荧光染色,发现CAF sEVs被FSP-1阳性细胞摄取,部分sEVs与I型胶原共定位。说明CAF sEVs的靶细胞可能是肺成纤维细胞（Lung Fibroblast,LF）。我们在体外用CAF sEVs诱导LF,40min后,将UM-SCC6细胞接种到处理后的LF上,结果显示CAF-sEVs处理过后的LF黏附的肿瘤细胞数量明显高于空白对照组（*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001）。结论:1.OSCC来源的CAF-sEVs携带的LOX可以促进肺纤维化。2.BAPN可以通过抑制LOX活性来降低CAF sEVs促进肺纤维化的能力。3.CAF-sEVs可以通过靶向LF,并提高其促肿瘤细胞黏附的能力。