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肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率很高。手术切除、放射性治疗和化学药物治疗等传统疗法对中晚期肝癌患者疗效不佳。用对肿瘤具有高度特异性的物质作为载体,向肿瘤细胞靶向递送抑肿瘤细胞生长因子所对应基因的治疗技术,为治疗恶性肿瘤提供了一种新途径。生长抑制因子4（ING4）和白细胞介素-24（IL-24）基因,是目前肝癌基因治疗中效果较理想的细胞生长抑制因子,两者协同作用不仅能选择性地抑制肿瘤细胞生长和新血管形成,并且能诱导肿瘤细胞凋亡,同时对正常细胞均无显著的毒性。但细胞因子在体内的活性半衰期短,易失活或被降解。因此,寻找安全、高效的基因载体,将抑肿瘤细胞生长因子的基因装载、靶向递送到细胞内部,使其稳定、高效地表达,合成对应的抑肿瘤细胞生长因子,诱导肿瘤细胞凋亡,是肿瘤基因治疗的关键。柞蚕丝素蛋白具有良好的生物相容性、低免疫原性、可生物降解性等优点。柞蚕丝素蛋白氨基酸序列中含有大量的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸三肽序列,该序列能特异性识别、结合恶性肿瘤细胞表面以及肿瘤增殖新生血管内皮细胞表面高表达的αvβ3整联蛋白受体,并且在柞蚕丝素蛋白中含有大量带有极性和侧基可电离的氨基酸残基,这些氨基酸残基可作为对柞蚕丝进行化学修饰的位点。FQHPSFI七肽（HCBP1）是一种对肝癌细胞具有高度特异性的小分子肽,它可在体外和体内识别肝癌细胞、结合于细胞表面,是一种具有开发和应用前景的肝癌靶向性配体。本文用低分子量的聚乙烯亚胺（1.8 kDa）对柞蚕丝素蛋白进行化学改性,使柞蚕丝素蛋白表面带上正电荷,然后在阳离子化柞蚕丝素蛋白的表面接枝能特异性识别肝癌细胞的HCBP1肽,包裹ING4和IL-24双基因编码的pDNA形成复合物,保护、压缩pDNA并使其表面带正电荷,制备肝癌细胞靶向肽修饰的阳离子化柞蚕丝素蛋白与ING4-IL-24双基因共表达质粒复合物（CASFP/pDNA）,用该复合物分别转染肝癌细胞HepG2和正常肝细胞L-02,研究不同质量比的复合物对肝癌细胞的转染效果、抑细胞生长能力以及对正常细胞毒性的影响。首先,在碳化二亚胺介导下,使柞蚕丝素蛋白侧链上的羧基与聚乙烯亚胺上的氨基反应生成新的酰胺键,对柞蚕丝素蛋白进行阳离子化改性。研究表明,与未改性的柞蚕丝素蛋白相比,经聚乙烯亚胺改性的柞蚕丝素蛋白的Zeta电位由负值翻转为正值。随着聚乙烯亚胺与柞蚕丝素蛋白质量比的增大,改性后柞蚕丝素蛋白的Zeta电位增大,当聚乙烯亚胺与柞蚕丝素蛋白质量比为4%时,Zeta电位值可达到+11.33±0.38mV。同时,改性后的柞蚕丝素蛋白的等电点由4.31增大到9.38,表明经改性后的柞蚕丝素蛋白表面带大量的正电荷。1H-NMR和FT-IR测试结果表明,聚乙烯亚胺被共价连接于柞蚕丝素蛋白的侧链,达到了对柞蚕丝素蛋白进行阳离子化改性的目的。其次,在3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯介导下,使阳离子化柞蚕丝素蛋白（CASF）侧链上的氨基与HCBP1的巯基反应,将HCBP1以二硫键的形式连接到CASF侧链上,制备HCBP1肽修饰的阳离子化柞蚕丝素蛋白（CASFP）。实验结果显示,经HCBP1肽修饰后的CASF的Zeta电位值减小。且随着HCBP1/CASF质量比的增大,修饰后的CASF的Zeta电位减小,当HCBP1/CASF质量比为1/400时,Zeta电位值约为+8.22±0.62 m V。1H-NMR和FT-IR测试结果表明,CASF侧链上的-NH2与HCBP1的-SH反应,可将HCBP1共价连接到CASF的侧链上。然后,用静电吸附法制备不同质量比的CASFP/pDNA复合物,琼脂糖凝胶电泳结果显示,CASFP能够将pDNA完全包覆。CASFP/pDNA复合物的表面Zeta电位随CASFP/pDNA质量比的增大而增大,复合物粒径为300-600 nm,粒径随着CASFP/pDNA质量比的增大而减小。SEM、TEM、荧光倒置显微镜、EDS对复合物进行的观察和分析结果表明,复合物形态均一、结构紧密,进一步证明了CASFP能够包裹、压缩pDNA形成数百纳米的球状颗粒。最后,在体外用CASFP/pDNA复合物转染HepG2细胞。转染24 h后,细胞形状变圆、体积变小、并表现出与其他细胞分离等凋亡特征。当CASFP/pDNA质量比为256/2时,转染HepG2细胞24 h后,其转染效率可以达到了13.03%,接近于25 k Da PEI的15.51%。而CASFP/pDNA复合物转染L-02细胞24 h后,细胞则能正常贴壁铺展生长、形态良好,细胞活力显著高于25 kDa PEI转染的细胞,表明CASFP/pDNA对正常肝细胞的生长无显著影响。这些结果表明,CASFP/pDNA复合物不仅能够转染肝癌细胞、抑制肝癌细胞生长、促进肝癌细胞凋亡,而且对正常细胞无明显的毒性。本文构建的肝癌细胞靶向肽修饰的阳离子化柞蚕丝素蛋白与ING4-IL-24双基因共表达质粒复合物CASFP/pDNA,为肝癌提供了一种新的基因治疗系统,具有开发、应用于临床的潜力。