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电压门控氯离子通道蛋白(voltage-gated chloride channel,Cl C)属于氯离子通道蛋白中的一个大家族,普遍存在于真核与原核生物中,主要位于各类细胞的细胞质膜或器膜上,可调控不同的生理过程和细胞功能。氯离子通道蛋白2(Chloride channel protein 2,Cl C-2)是电压门控氯离子通道家族的一员。迄今为止,虽然对Cl C-2基因和蛋白质分子结构的研究取得了一些进展,但其结构、功能及调节机制等仍不完全清楚。目前对Cl C-2的研究主要集中在人类、小鼠和植物中,在昆虫中几乎没有报道。家蚕(Bombyx moir)是最早完成基因组测序的鳞翅目昆虫,完善的基因组、表达谱和蛋白组数据库为家蚕基因的功能研究提供了重要的平台。本研究利用生物信息学技术鉴定了家蚕Cl C家族基因,并探究了Cl C-2基因功能。1、对家蚕基因组进行筛选,首次鉴定到3个Bm Cl C基因家族成员,分别位于第1、17和27号染色体上;并依据Bm Cl Cs基因的蛋白质序列进行初步聚类,这3个基因的外显子内含子数目不一样,3个Bm Cl C蛋白为疏水性蛋白,且具有相似的蛋白保守结构域,但仍然存在基序的多样性,它们有可能作为潜在的蛋白质-蛋白质间的相互作用结构域辅助Cl C蛋白的作用。利用Real-time PCR技术分析了3个Bm Cl C基因在家蚕9个组织的表达情况,结果表明3个Bm Cl C基因在脂肪体的表达量最高,推测Bm Cl Cs可能在家蚕营养运输过程中起着关键作用。2、对位于27号染色体上的Bm Cl C基因家族中的Bm Cl C-2(BGIBMGA004625)基因进行全长克隆,得到家蚕BY品种中该基因全长是4808 bp,开放阅读框的为2865 bp,起始密码子位于全长的第310-312位,终止密码子位于第3170-3172位,编码区由954个核苷酸组成;XBY品种中Bm Cl C-2基因全长是4774 bp,开放阅读框与BY品种相同,起始密码子位于全长的第284-286位,终止密码子位于第3144-3146位,编码954氨基酸。将以BY为模板扩增得到的Bm Cl C-2基因全长序列提交到NCBI,Gen Bank登录号为MT353899。对家蚕Bm Cl C-2基因的序列进行分析,经比对得到的两个家蚕品种的Bm Cl C-2编码区,发现在第933氨基酸位点有一个有义突变,但蛋白质的二级结构无变化,两个品种的非编码区都有缺失和增多的部分,有待于进一步研究。生物信息学分析表明,Bm Cl C-2编码954个氨基酸残基,分子量是105.76 k D,理论等电点是9.48,平均亲水性值为0.11127,为疏水蛋白,存在Cl C-1-like、Vottage-CLC、Clc A、PRK05227、CBS等结构域,定位于细胞膜,无信号肽,存在12次跨膜结构,同时对Bm Cl C-2的抗原表位区进行预测,通过综合分析,将640-855 aa作为抗原区段。对Bm Cl C-2全组织表达情况进行RT-PCR和q PCR研究发现,Bm Cl C-2基因在两个品种的9个组织中均有不同程度的的表达,且在中肠、马氏管和生殖腺的表达量较高,添家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus,Bm NPV)24小时后,两个品种中的Bm Cl C-2基因表达量差异最大的是中肠、生殖腺和气管丛。3、构建p ET-28a(+)-Bm Cl C-2原核表达载体,高效表达重组融合蛋白,并纯化含His标签的重组Bm Cl C-2蛋白,制备特异性良好,效价较高(1:288650)的多克隆抗体,为分析该蛋白在家蚕中的功能奠定了基础。4、通过对Bm Cl C-2在家蚕各发育时期及2个品种五龄幼虫经Bm NPV处理后各组织中的表达情况进行研究,发现该蛋白在家蚕蛾期几乎不表达,卵期表达量最高,2个品种经Bm NPV侵染与未侵染,该蛋白在各组织均有不同程度的改变。表达图谱分析表明Bm Cl C-2在卵期胚胎发育的营养运输过程中可能起着很大的作用,Bm NPV会影响该蛋白在各个组织的表达。RNA干扰后,荧光显微镜下观察XBY的血细胞呈绿色荧光,表明其血细胞中存在Bm NPV,说明Bm Cl C-2被干扰后抗性品种XBY失去对Bm NPV抗性;个体存活率调查也证明,Bm NPV侵染的XBY品种个体最终被病毒感染而亡,初步证实了Bm Cl C-2在家蚕抗Bm NPV过程中可能起到一定作用。