目的:核纤层蛋白位于细胞核内层核膜下，通过绑定各种细胞核蛋白进而参与细胞核及核骨架的组装、维持核骨架及基因组的稳定、调控染色质及基因的表达、调节细胞分化等诸多细胞内活动。Lamins蛋白可分为A型、B型和C型，而B型又分为B1和B2两种亚型。Lamins A和C是由同一个基因通过选择性剪切而获得的。Lamins B1和B2分别由LMNB1和LMNB2编码，在细胞发育和分化过程中表达。近年来关于Lamins与肿瘤间关系的研究越来越多，如:Lamin A/C高表达与结肠癌预后较差和干细胞样特征相关，而在Ⅱ期、Ⅲ期结肠癌中Lamin A/C低表达与复发风险增加有关。Lamin A/C高表达还与神经母细胞瘤、前列腺癌、肝细胞癌、乳腺癌、低级别子宫内膜癌的预后差有关。Lamin A/C在肺腺癌细胞中比率及分布异常。而关于Lamin B的研究仅见Lamin B1在肝细胞癌、前列腺癌、胰腺癌其表达升高预示预后差。关于Lamin B2与肿瘤细胞增殖的关系仅有两份报道:其一是Lamin B2在卵巢癌中高表达，另一例是Lamin B2在前列腺癌中低表达。　　微小染色体维持蛋白(Minichromosomal maintenance，MCM)家族有MCM2-7六个蛋白成员，这六种蛋白在DNA复制前期（G1早期），形成一个环形异六聚体复合物，并与Cdc6、Cdt1相互作用，在Cdc45引导下，绑定到DNA双链的复制起始点，MCM4/6/7作为复合物的催化核心，发挥解旋酶作用，而MCM2或MCM3/5则发挥调控MCM复合物活性的功能，当DNA复制完成后与其分离，以确保DNA复制期的正常进行以及每个复制周期DNA只复制一次。近年来的研究表明，MCM7在非小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌及神经母细胞瘤中均为高表达且与不良预后相关。　　RB是染色质结合蛋白，通过管理转录因子E2F，来限制细胞周期基因的转录及细胞增殖基因的表达。RB的活性受细胞周期蛋白依赖激酶的调控，在G1/S交界期，RB被CDK磷酸化而失活，释放E2F促进细胞进程。研究表明，RB蛋白的持续失活会导致肿瘤的发生。　　综上所述，以上三种蛋白的表达改变均与肿瘤的发生相关，而本研究的主要目的是:通过实验明确Lamin B2在非小细胞肺癌增殖方面所起的作用及与MCM7和RB之间的关系。具体如下:1.证实LaminB2在肺癌组织中高表达。2.证实LaminB2可促进非小细胞肺癌增殖。3.证实Lamin B2与MCM7直接结合，增强MCM7解旋酶的活性、提高与染色质结合的能力，进而影响非小细胞肺癌的增殖、肿瘤形成及DNA的复制。4.证实Lamin B2与RB在MCM7的C端存在竞争性结合的关系。5.证实Lamin B2与MCM7在肺癌组织中高表达与临床病理因素及不良预后相关相关。　　研究方法:1.组织来源、组织芯片及免疫组化:本研究中Western blot和qPCR用到的组织，均在中国医科大学伦理委员会监督下进行。在中国医科大学附属第一医院搜集2008-2015年20例对应的癌及癌旁正常肺组织(距肿物边界大于5cm)标本，所有标本来源的患者均接受肺癌手术但没有接受过术前放化疗治疗，而且具有完整的随访资料，随访从手术之日起到随访结束日期或由于复发、转移而死亡之日止。根据WHO-2015肺癌组织学分类标准和2010年国际抗癌联盟TNM分期标准进行重新评估。组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司且有完整详细的芯片资料。芯片经二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水，抗原修复步骤后，采用S-P试剂盒进行组化反应(KIT-9710，Ultrasensitive TM S-P, MaiXin，China)，利用Lamin B2(1∶100;Abcam)抗体进行一抗孵育4℃过夜。生物素标记的二抗(Ultrasensitive; MaiXin，Fuzhou，China)37℃孵育30分钟，DAB显色。在每块芯片的组织点上，随机选5个视野，每个视野都进行计数约500个细胞。然后依据所计数的细胞着色的百分比，将表达Lamin B2的细胞数目进行划分，五个等级分别为:0分（无细胞着色），1分(1-25％的细胞着色)，2分(26-50％的细胞着色)，3分（51-75％的细胞着色），4分(76％以上的细胞着色)。依据细胞着色的强度，我们将Lamin B2的表达划分成2个等级:1分（浅黄色颗粒），2分（深黄色颗粒）。每张切片的最终得分为:切片细胞数目等级评分与着色分数等级评分的乘积。将得分小于或等于4判为低表达，而将得分大于4判为高表达。　　2.细胞培养与试剂:人肺腺癌细胞系A549和H1299均购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。细胞培养于37度、5％二氧化碳的细胞培养箱内。培养基为RPMI-1640及10％胎牛血清(Gibco，Life Technologies)和1％的青霉素-链霉素(JRH Biosciences,St.Louis,MD,USA)。质粒pCMV6-LMNB2-GFP(5-GGACTTTCCAAAATGTCG-3;5-ATTAGGACAAGGCTGGTGGG-3)和对照组GFP-vector均购自于OriGene Technologies(Beijing，China)。质粒pENTER-MCM7-Flag(5-GATCGCCATGGGGCACTGAAGGACTACGCGC-3,5-TTGGCGCGCCAACCGGGGTGTGACAAAA TGATCC-3）及突变体质粒pENTER-△MCM7-VS(5-GATCGCCATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCCGGTCTCGATTCTACGGCACTGA AGGACTAC-3,5-TTGGCGCGCCAACCGGGGTGTGACAAAATGATCC-3）均购自于上海泰和生物技术有限公司。干扰质粒LMNB2(LMNB2-RNAi)(5-TGGAGATCAACGCCTACCG-3，5-AGCCGCTTCCG CTTAC TG-3)及对照组质粒(NC-RNAi)均购自于上海吉凯生物技术有限公司。　　3.蛋白电泳:采用RIPA裂解液提取肺癌组织或培养细胞中的蛋白(Millipore，Billerica，MA，USA)，用分光光度记，以胎牛血清作为标准进行蛋白定量，计算各样品蛋白浓度。将含80μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳1.5h后，用PVDF膜转印(220mA，1.5h)，5％脱脂奶粉室温封闭1.5h，用TTBS(20mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，0.05％ Tween-20)冲洗3次/5分钟，单克隆抗体Lamin B2(1∶1000，Abcam，美国)4℃放置过夜后，辣根过氧化物酶标记的二抗37℃放置1.5h，TTBS洗3次/5分钟，ECL发光液显色。以GAPDH为内对照，用凝胶成像分析系统(Biolmaging Systems)检测条带灰度值，并取其与GAPDH的比值做为相对表达量。　　4.RNA提取及qPCR:使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen，Hilden，Germany)从细胞中提取总RNA。根据PrirneScriptTM RT Master Mix(TaKaRa，China)实验说明书，1微克RNA用于逆转录实验。qPCR采用使用总量为20微升体系的SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, Foster City, CA)在ABI7900 PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)中完成。运行qPCR反应板热循环反应为50℃2min，95℃10min，95℃40s，40个循环，然后60℃60s。GAPDH作为内参，基因表达的倍数改变采用2-ΔΔCt方法计算，实验重复3次。　　5.克隆形成:A549和H1299细胞转染24小时后接种到40mm培养皿（每孔1000个细胞）生长12天，每4天换一次含10％胎牛血清的培养基一次。用苏木素染色并计数大于50个细胞的集落。　　6.MTT实验:消化并收集对数生长期细胞，进行细胞计数，调整细胞悬液浓度至1.0×104个/ml后，接种于96孔板，细胞数为1.0×103个/孔，次日细胞贴壁并进行干扰质粒转染，于37℃，5％ CO2培养箱中分别培养至12h、24h、48h、72h后，每孔加入5 mg/ml MTT20μl，置培养箱中孵育4h后吸去各孔中培养液，加入200μlDMSO以溶解细胞形成的结晶，在酶标仪上测定其在490 nm处OD值，每种细胞每个浓度检测8孔，以其平均值为该时段光吸收值，进行数据分析。　　7.流式细胞术检测细胞周期:消化并收集转染后培养48h的细胞制成1×107/ml细胞悬液，取1ml细胞悬液加入预冷75％乙醇，4℃固定2h后，离心收集细胞，弃去上清液，每管细胞样品中加入500μl染色缓冲液重悬。加入25μl碘化丙啶(PI)染色液(Sigma，美国)混匀后，加入10μl RNase A混匀，37℃避光温育30 min后冰浴避光存放，随即进行流式细胞术检测，ModFit LT3.0软件分析细胞周期。　　8.免疫荧光实验:细胞经4％多聚甲醛固定，0.2％TritonⅩ-100打孔5分钟，用5％BSA室温封闭1小时后，加入一抗，4℃孵育过夜，次日加入山羊抗兔/鼠二抗、罗丹明二抗避光孵育。细胞核采用DAPI染色，甘油封片，采用Radiance2000荧光共聚焦显微镜(Carl Zeiss，Thomwood，NY, USA)采集图片。每一步染色之后均用PBS洗3三次/5分钟。　　9.免疫共沉淀:将收集到的细胞用预冷的PBS洗涤后，用NP-40及1％PMSF裂解。4℃环境下15000g离心25分钟，每毫克蛋白裂解液加5ug抗体4℃摇床过夜，加50％Immunomagnetic Beads Protein G磁珠(sinobiological，Beijing)50ul，4℃摇床4小时后收集磁珠做蛋白电泳分析。　　10.酵母双杂交:本实验酵母双杂交系统的pGADT7-AD克隆载体、pGBKT7-BD克隆载体（诱饵表达质粒）、BD阳性对照质粒pGBKT7-T、BD阴性对照质粒pGBKT7-1am、酵母双杂交系统MATCHMAKER Gal4、酵母菌株AH109、酵母菌培养液YPDA、人工合成营养缺陷型培养液（SD-Trp、SD-Leu、SD-Trp/Leu/His和SDTrp/Leu/His/Ade）和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-gal）均购自Clontech公司。酵母双杂交检测:诱饵表达质粒pGBKT7-MCM7的构建及鉴定:构建MCM7全长的引物(5CAGCCAAGCTCAACATATGGCACTGAAGGACTACGCG3,5TTCATTTCAAGCAAAGTCGACGGAGTAAGTGCAGCATGGGAG3)后，利用PCR法在目的片段的两端引入限制性内切酶Nde1和Eco R1，随后采用双酶切位点定向亚克隆至载体pGBKT7中，转化大肠埃希菌Top10C，氨苄青霉素筛选阳性克隆，扩增培养后提取质粒DNA，再用Nde1和Eco R1双酶切处理提取的质粒，鉴定插入片段大小，即为构建获得的诱饵质粒pGBKT7-MCM7，测序后，与GenBank MCM7基因序列比较同源性。按照MATCHMAKER GAL4操作手册，采用醋酸锂法将诱饵表达质粒pGBKT7-MCM7与前期工作中筛选获得的、经测序鉴定证实的质粒pGADT7-Lamin B2(建于如前所述)，共同转化至酵母菌株AH109中，随即涂布于含SD-Trp/Leu/His/Ade-X-gal的平板上，30℃条件下培养至菌落生成，并重复传代3次。　　11.GST融合蛋白及GST-pulldown:构建pGST-MCM7突变体:pGST-MCM7N，pGST-MCM7 M，pGST-MCM7 C。将含有各突变体蛋白及GST蛋白的大肠杆菌在100ml的Luria-Bertani培养基及氨苄西林(60 ug/ml)中37℃过夜，后加IPTG诱导30℃、3小时，冰上1％ Triton X-100裂解超声，收集蛋白15，000g、15分钟，取上清加GST磁珠摇床3小时，离心15，000g、15分钟取沉淀为后续蛋白电泳做准备。　　12.染色质关联分析:细胞裂解液悬浮于试剂A(110 mM KC2H3O2，15mMNaC2H3O2,2 mM MgC2H3O2,0.5 mM EGTA,20 mM HEPES pH7.3)，并加入2mMDTT和50μg/ml洋地黄皂苷，4℃、10分钟后，1500g离心10分钟后，悬浮于高渗溶液B中1mM HEPES pH7.5，0.5 mM EDTA supplemented with0.5％ NP-40)孵育15分钟后倒入10ml蔗糖垫溶液中(100 mM蔗糖，0.5 mM Tris-HCl，pH8.5)，离心3500g、15分钟。染色质沉淀悬浮于0.25 mM EDTApH8.0中超声3次×10秒，高速离心两次，每次10分钟，将所得沉淀进行蛋白电泳实验。　　13.解旋酶活性实验:细胞裂解液与MCM7抗体共同孵育2小时后，加入如前所述的免疫共沉淀磁珠进行分离，将分离后的沉淀与pUC19模版共同孵育(5-CAAGTTGGGAAGACAACCTG-3/5-Cy5-CCAATATGGTGAAACCCCGT-3)于20 mmol/L Tris-HCl, pH7.4,50 mmol/L NaCl,3mmol/L MgCl2,2mmol/L ATP,20％甘油，0.1％胎牛血清溶液中，加入探针(5-CAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGT-3)室温孵育30分钟后，170 mmol/L EDTA，pH8.0溶液终止反应。用streptavidin-agarose磁珠进行捕获后Tris-Tween-20溶液洗三次，用Thermovarioskan flash测荧光值并做统计分析。　　14.裸鼠成瘤实验:20只BALB/c裸小鼠，5周龄，雌性（从上海史莱克公司购买）饲养于恒温，恒湿的半屏障系统中饲养。按照中国医科大学动物实验伦理条例实施动物实验。将转染了LMNB2-RNAi及NC-RNAi质粒的H1299细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液用细胞计数板对细胞进行计数，并最终用一定体积的D-Hanks重悬，使细胞悬液的浓度为3×106个细胞/ml，然后用一次性注射器，吸取1mL，皮下注射至动物右前肢腋下。每只200ul。25天后，每两天观察一次成瘤情况并测量肿瘤大小，动物体重。测量两周后在处死动物前对动物进行活体成像，成像仪(BERTHOLD TECHOLOGIES，LB983):按10ul/g的量，腹腔注射0.7％戊巴比妥钠麻醉动物，数分钟后待动物麻醉，将其放置于活体成像仪下进行成像，观察荧光，保存数据。然后实验动物进行颈椎处死。在白板上排列好动物，并将把标尺分别放在左侧与上方，用来观察具体刻度，用照相机拍下动物照片。然后用医用剪刀和医用镊子小心取出肿瘤，在白板上整齐排列好后拍照保存。同样需要标尺作为参照，读取刻度，并将取出的肿瘤称重。整理数据，分析结果。　　15.统计分析:所有的数据采用SPSS22.0版本进行统计学分析。采用Chi.Square检验Lamin B2表达与临床病理因素之间的关联。采用t检验检测Western Blot结果中的灰度值、集落形成实验结果计数等。P＜0.05作为有统计学意义。　　结果:1.Lamin B2在肺癌组织中高表达。与癌旁组织相比，在癌组织中LaminB2的基因，蛋白及mRNA水平均高表达(P＜0.01）。2.Lamin B2促进肺癌细胞的增殖。干扰Lamin B2抑制肺癌细胞的增殖(P＜0.01）并促进凋亡(P＜0.01)，抑制细胞进入S期;而转染Lamin B2促进肺癌细胞增殖(P＜0.01），抑制凋亡(P＜0.01)，促进细胞进入S期。裸鼠体内成瘤实验证实，Lamin B2促进非小细胞肺癌的肿瘤形成(P＜0.01）。3.Lamin B2与MCM7的C端直接结合，增强MCM7的功能，促进肺癌细胞的增殖。酵母双杂交、免疫荧光及免疫共沉淀的实验结果均表明，Lamin B2与MCM7可在体内、外直接结合，且共定位于细胞核，同时Lamin B2不能与MCM其他家族成员结合，而MCM7亦不与Lamin家族的其他成员相结合。进一步应用GST pull-down实验，我们发现二者结合域位于MCM7的C端。构建MCM7 C端缺失突变体，将共转染全长MCM7及Lamin B2作为对照组，共转染缺失突变体及Lamin B2作为实验组，结果显示，对照组细胞增殖的能力不如实验组细胞增殖能力强，即当Lamin B2与MCM7的C端结合才能发挥促进肺癌细胞增殖的作用(P＜0.01)。同时，当二者结合后，LaminB2可促进MCM7的功能:即干扰LaminB2的表达可减弱MCM7解旋酶的活性(P＜0.01），降低MCM7与染色质结合的能力，转染LaminB2后MCM解旋酶活性及其与染色质结合的能力均增强(P＜0.01)。4.LaminB2与RB竞争性结合MCM7C端。免疫荧光及免疫共沉淀的实验均证实，RB可与MCM7C端直接结合。应用ELISA及滴度共沉实验证实Lamin B2与RB存在竞争性结合的关系(P＜0.01）。转染Lamin B2后，由于Lamin B2与RB竞争导致RB与MCM7的结合减少（P＜0.01），相应磷酸化的RB增多(P＜0.01），释放更多的E2F(P＜0.01)，促进细胞的增殖及细胞周期，而干扰LaminB2后以上现象均相反。(P＜0.01)。5.Lamin B2与MCM7在肺癌组织中高表达与临床病理因素及不良预后相关相关。我们分别对Lamin B2及MCM7的150例组织芯片进行统计学分析，结果证实Lamin B2与MCM7在肺癌组织中高表达与临床病理因素中肿瘤的分化程度(P＜0.05)及TNM分期(P＜0.05)相关且与不良预后亦相关(P＜0.05)。　　结论:1.Lamin B2在肺癌组织中高表达。2.Lamin B2促进非小细胞肺癌的增殖。3.Lamin B2与MCM7C端直接结合，增强MCM7解旋酶活性及与染色质结合的能力，进而促进肺癌细胞增殖。4.Lamin B2与RB竞争性结合MCM7C端。5.Lamin B2与MCM7在肺癌组织中高表达与临床病理因素及不良预后相关相关。